牙本质基质蛋白-1的研究进展

    作者：张杰华综述 万乾炳审校    作者单位：四川大学华西口腔医院修复科 四川 成都 610041

     【摘要】  牙本质基质蛋白-1是牙发育过程中一种非常重要的非胶原性基质蛋白，对牙本质的形成和矿化起着重要的作用，但其具体的作用机制有待于进一步的研究。下面就牙本质基质蛋白-1的表达定位、基因结构、生物学功能以及表达调控因素作一综述。

    【关键词】  牙本质基质蛋白-1； 表达定位； 基因结构； 生物学功能

    Research advances of dentin matrix protein-1  ZHANG Jie-hua, WAN Qian-bing. （Dept. of Prosthodontics,West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

    [Abstract]  Dentin matrix protein-1 is an essential non-collagenous protein in dentinogenesis. It is believed to play a crucial role in the formation and mineralization of dentin, although the mechanism requires further study. The expression orientation, gene structure, biological function and regulation of dentin matrix protein-1 in dentin and bone was reviewed in this paper.

    [Key words]  dentin matrix protein-1； expression orientation； gene structure； biology function

    早在1993年，George等[1]在筛选3周龄S-D大鼠切牙成牙本质细胞牙髓复合体的cDNA文库时发现了牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）-1。该蛋白属于细胞外基质蛋白的小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族。DMP-1富含天门冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸，是一种分泌性磷酸化蛋白，其组成介于骨酸性蛋白和牙本质磷蛋白之间。诸多研究证实，DMP-1是牙本质形成和矿化的重要的基质蛋白。

    1  牙本质基质蛋白-1的表达定位

    1.1  牙本质基质蛋白-1的组织表达定位

    起初，许多学者认为Dmp-1只表达于牙中，是牙本质特异性蛋白，尔后随着研究的逐渐深入，在其他组织中也检测到dmp-1 mRNA的表达。自从在成熟的牙本质细胞中发现dmp-1 mRNA的表达后，在成牙本质细胞、成釉细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞中也检测到了dmp-1的转录物，即在其他矿化组织中，如釉质、骨、牙骨质中有Dmp-1的表达。另外，Dmp-1也表达于脑、胰岛以及肾脏的小管上皮、远端小管和亨勒环中。Hirst等[2]在对脑、骨以及成牙本质细胞的转录物表达水平的比较中发现，Dmp-1表达水平最高的是脑，其次是骨和成牙本质细胞。胎牛脑中的Dmp-1表达可能是一过性的，随着其生长和发育，Dmp-1在胎牛脑中的表达消失或降低。值得关注的是，Dmp-1也表达于癌性病损组织[3]。

    1.2  牙本质基质蛋白-1的时空表达定位

    目前，有关Dmp-1时空表达定位的研究主要集中于牙和骨组织中。不同片段的DMP-1启动子在不同的细胞中活性不同，譬如在人牙髓干细胞和成骨细胞等矿化细胞中活性较强，而在海拉细胞（子宫颈癌上皮细胞株）等非矿化细胞中活性最低[4]。对Dmp-1在大鼠牙组织中的研究发现，Dmp-1在大鼠磨牙的整个发育阶段都有表达[5]。在2周龄大鼠的前期牙本质中，可检测到Dmp-1的免疫反应，即在成牙本质细胞中有Dmp-1的表达q。随着时间的延长直到第5周，Dmp-1的表达逐渐增强。dmp-1 mRNA在成牙本质细胞中的阳性表达始于其分化的分泌期，呈由牙尖到牙颈部的递q增模式，而对于成熟期的成牙本质细胞，dmp-1 mRNA的表达则降至基础水平。当用酪氨酸激酶拮抗剂抑制Dmp-1磷酸化时，Dmp-1只在釉质中表达，在成牙本质细胞中则没有表达。

    Massa等[6]应用高分辨率的免疫组q化法研究了牙生成早期Dmp-1的时空表达定位。超微结构显示Dmp-1出现于牙生成的早期，且定位于分化中的成牙本质细胞的高尔基复合体和细胞核。当矿化由基质小泡发展到周围基质的晚期时，在细胞外的矿化小球周围也可检测到Dmp-1。在高度矿化的层状牙本质区，Dmp-1主要见于管周牙本质以及牙本质与前期牙本质之间的矿化前沿。

    dmp-1 mRNA连续性的表达，缘于下颌骨处于不断地改建之中。Kamiya等[7]的研究，让人们对大鼠下颌骨骨形成过程中dmp-1 mRNA的表达有了进一步的了解。在胚胎的第15天，dmp-1mRNA的表达只局限于若干成骨细胞；在胚胎的第16～18天，dmp-1的表达随成骨细胞的增加而增加；在胚胎的第20天，其表达亦见于骨细胞，且表达一直持续到第90天的成熟个体。而在成骨细胞中，dmp-1的表达仅见于大鼠出生后的第14天且呈一过性。在骨折愈合过程中，dmp-1 mRNA的q表达与下颌骨形成过程中dmp-1 mRNA的表达略有不同。在软骨成骨和膜内成骨过程中，dmp-1 mRNA强烈表达于骨痂的前骨细胞和骨细胞。在膜内成骨中，少量表达Dmp-1的细胞见于一小簇肥大软骨细胞；然而，表达Dmp-1的细胞不肥大。推测该细胞可能是埋于骨或软骨基质的成骨细胞q系细胞。dmp-1 mRNA及其蛋白的表达升高直至骨折后2周骨痂形成，在以后的骨痂改建中表达降低。

    2  牙本质基质蛋白-1的基因结构

    George等[1]发现，dmp-1的翻译区长2 770 bp，编码489个氨基酸残基，其中信号肽的裂解位点位于第16个氨基酸残基的位置。除了信号肽序列，推导的分泌性Dmp-1氨基酸组成中酸性氨基酸远多于碱性氨基酸。dmp-1 cDNA3′非翻译区有1 000 bp和1个多腺苷酸化信号。重组体Dmp-1的相对分子质量为5.3×104，而体外培养的前牙牙本质中的Dmp-1的相对分子质量为6.1×104。Dmp-1有一个N-糖基化位点（340～342）和一个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）黏附序列（337～339）。

    人以及牛、鼠的dmp-1有一些高度保守区，如疏水的16-氨基酸残基信号肽，与细胞黏附有关的RGD序列，数个可能是酪蛋白激酶Ⅰ、Ⅱ磷酸化位点的丝氨酸残基等。人dmp-1定位于染色体4q21上，其5′端有99 bp的非编码区（untranslated region，UTR），1 539 bp组成的开放阅读框，编码513个氨基酸残基构成的强酸性蛋白：丝氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸分别占21.4%、15.6%和12.1%。其3′端有1 041 bp的UTR，包括一个聚腺苷酸化信号。人的dmp-1由6个外显子和5个内含子构成。外显子1包括一个78 bp的UTR；外显子2包括一个21 bp的UTR，编码18个氨基酸，其中包括由16-氨基酸残基构成的信号肽和N端的2个氨基酸；外显子3～5分别长48、33和48 bp，它们分别编码16、11和16个氨基酸；外显子6长1 320 bp，编码 RGD序列、终止子等 453个氨基酸。

    骨细胞外基质含起源于短链dmp-1，即37～57 kb的片段。有关胰蛋白酶肽序列分析表明，37 kb片段源于dmp-1的N末端（sub2），57 kb片段源于C末端。磷酸盐分析表明，37 kb片段含有12个磷酸盐，57 kb片段有含有41个磷酸盐。从37 kb片段得到的两种肽缺乏C末端赖氨酸或精氨酸，取而代之的则以苯丙氨酸和丝氨酸结尾。源于57 kb片段的N末端的2种肽，起始于天冬氨酸（sup218和sup222）。这些发现表明，Dmp-1在苯丙氨酸（sup173）-天冬氨酸（sup174）、丝氨酸（sup180）-天冬氨酸（sup181）、丝氨酸（sup217）-天冬氨酸（sup218）和谷氨酰胺（sup221）-天冬氨酸（sup222）4个带上可进行蛋白水解，形成8个片段。天冬氨酰残基（sub2）N末端肽带断裂位点的一致性表明，蛋白水解过程仅涉及单个蛋白水解酶，并假定其分裂由X染色体上磷酸盐调节基因中性肽链内切酶（phosphate regulating gene with homologies toendopeptidase on the X chromosome，PHEX）催化。

    3  牙本质基质蛋白-1的生物学功能

    Dmp-1在牙胚发育过程中具有诱导成牙本质细胞分化和分泌，启动牙本质矿化和充当细胞间信号分子等作用。未分化的间充质细胞在特定信号分子作用下可分化为成牙本质样细胞[8-9]。在多潜能细胞和间充质源性细胞，如C3H10T-1/2、MC3T3-E1和RPC-C2A中过表达Dmp-1，可诱导这些细胞分化并形成成牙本质细胞样细胞。体外矿化结节形成试验证实，体外过表达Dmp-1的细胞能够诱导分化和促进矿化结节的形成。在牙本质牙髓复合体中，Dmp-1对未分化间充质细胞起着形态发生蛋白的作用。在胶原基质、成牙本质细胞特异性标志和钙化沉积物的共同作用下，这些分化成熟的细胞可产生牙本质样组织。

    Dmp-1虽然不是小鼠骨和牙发育早期所必须的，但却是早期成牙本质细胞所必须的，在成熟的牙本质细胞中的持续表达对正常的牙生成也是不可缺少的。Dmp-1是成牙本质细胞分化、牙本质小管系统的形成和牙本质矿化的重要调控因子[10]。2005年，Lu等[11]在测定了dmp-1的2.4 kb和9.6 kb启动子区的DNA片段后发现，2.4 kb成熟片段的dmp-1启动子在牙生成早期发挥作用，而2.4～9.6 kb片段间的启动子区域包含牙生成后期dmp-1表达的控制域。对于出生后的小鼠骨和牙发育来说，dmp-1的表达更是不可或缺的[12]。dmp-1缺失的小鼠出生后3 d到1年，牙发育出现了前牙牙本质矿化障碍，牙腔扩大，牙本质层厚度变薄、前牙牙本质区增宽，矿化不足等重要的表型特征。由于这些表现与牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）基因缺失小鼠的表现惊人的相似，因此许多学者推测在牙生成中Dspp可能受Dmp-1的调节[13-14]。在成牙本质细胞分化早期，Dmp-1位于其核内，可特异性地与dspp启动子结合，激活dspp的转录。染色质免疫沉积法也证实了体内dmp-1和dspp启动子相互关联。

    Dmp-1具有钙结合能力，可调节羟磷灰石的成核作用，从而启动其矿化过程[15-17]。Dmp-1的特异性结合以及其他非胶原蛋白在胶原纤维上的沉积，是胶原基质的形成和矿化的关键步骤。然而，并非每一种形式的Dmp-1都可调节羟磷灰石的成核作用[18]。天然形式、完整的Dmp-1抑制其矿化，而裂解的或去磷酸化的Dmp-1则可启动其矿化过程。高度磷酸化的C末端相对分子质量为5.7×104的片段是羟磷灰石的成核物。体外无磷酸化的重组蛋白也是羟磷灰石的成核物，磷酸化的重组Dmp-1对羟磷灰石的形成和生长无影响。

    Dmp-1不仅调节骨和牙的矿化，也调节体内磷的稳定[19]。Dmp-1缺失的个体会出现常染色体显性和隐性遗传低磷性佝偻病以及骨软化症，并伴随独立的肾磷流失与成纤维细胞生长因子-23水平的升高。常染色体隐性遗传性低磷性佝偻病dmp-1基因的突变，影响其起始密码子，下一代7个碱基对缺失打乱了Dmp-1高度保守的C末端，可引起牙生成缺陷和高骨量表型。故推测其可能存在一个引导矿化机制的骨-肾轴，但对于Dmp-1如何调节磷的自身稳定的机制还不清楚。

    此外，Dmp-1是出生后软骨形成以及后续成骨作用所必须的，在骨痂矿化中起着重要的作用。Dmp-1在一些软组织中的表达，使得人们推测Dmp-1除了调节矿化作用外可能还有其他功能[20]。

    4  牙本质基质蛋白-1的表达调控

    Dmp-1的表达受多种细胞因子、酶等因素的调控，其具体的机制有待于进一步研究。

    地塞米松在时间和剂量上可使Dmp-1表达升高，糖皮质激素拮抗剂RU486显著地抑制其表达。地塞米松通过激活核心结合因子（core bin－ding factor，Cbf）-α1来刺激Dmp-1的表达。然而，外源性的Cbf-α1过高表达却抑制dmp-1 mRNA的表达，原因可能在于地塞米松激活了Cbf-α1抑制Dmp-1表达的某些因素。许多研究发现，促丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase phosphatase，MKP）-1可通过降低Cbf-α1的磷酸化来影响地塞米松诱导的成骨细胞分化。在地塞米松处理的C26细胞转录事件中，尽管MKP-1可增加Cbf-α1的DNA结合活性，Dmp-1的表达可能还需要MKP-1和其他因素的共同作用来激活。

    巨噬细胞集落生成因子-1（colony-simulatingfactor-1，CSF-1）是单核巨噬细胞系细胞重要的调控分子，高表达于矿化组织，可能直接或间接地调控Dmp-1的表达。

    2002年，Narayanan等[21]通过对转录因子c-Fos和c-Jun（AP-1）调节dmp-1转录的研究发现，c-Fos和c-Jun对骨细胞的终极分化并无重要的作用。随后，他们又证实了在骨细胞分化中JunB转录调控dmp-1的表达。在矿化过程中，JunB与p300相互作用并调节dmp-1启动子的活性；而且，JunB第79丝氨酸位点的磷酸化是与p300相互作用所必须的。p300组蛋白乙酰转移酶的固有活性在调节dmp-1的表达中也起着重要的作用。

    有学者推测，BMP-1-tolloid样蛋白水解酶和PHEX参与Dmp-1的蛋白水解过程。Steiglitz等[22]已经成功地用BMP-1-tolloid样蛋白水解酶将全长的Dmp-1水解为不同的片段，大小与从骨内分离出来的相似，并且证实，从小鼠胚胎中提取的成纤维细胞如果缺乏这种水解酶，Dmp-1的处理过程就会发生缺陷。BMP-1-tolloid样蛋白水解酶对Dmp-1的蛋白水解加工在矿化组织过程中具有重要的作用。

    Dmp-1在组织中的表达十分广泛，其基因结构也已基本明确。Dmp-1对牙和骨的发育有重要的作用，但对于其功能的了解还不深入，Dmp-1的调控因素和基质也需要进一步的研究。

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