纳米复合树脂(Filtek Z350)对人牙髓细胞的毒性

作者：雷丽珊, 黄晓晶, 郑碧琼, 张 明, 钟 声, 林 昱　    作者单位：福建医科大学 附属口腔医院牙体牙髓科,福州 350002

【摘要】  目的 比较纳米复合树脂(Filtek Z350)与临床常用修复材料(Dyract-AP复合体、TPH复合树脂)的细胞毒性。 方法 原代培养人牙髓细胞(HPC),MTT比色法测定3种材料对HPC增殖的影响,扫描电镜观察HPC在材料表面生长情况。 结果 25%Filtek Z350细胞毒性为0级,小于Dyract-AP和TPH(P<0.05)。扫描电镜观察HPC在3种材料表面均可贴附生长。 结论 3种牙体修复材料对HPC的生长、增殖、贴附无不良影响,均具良好的生物相容性。Filtek Z350的细胞毒性小于Dyract-AP及TPH。

【关键词】  复合树脂类； 牙髓； 细胞毒性； 比色法； 氮蓝四唑； 显微镜检查，电子，扫描

    Cytotoxicity Test of Filtek Z350 Nano-Composite Resin

    upon Human Pulp Cell in Tissue Culture in vitro

    LEI Lishan, HUANG Xiaojing, ZHENG Biqiong, ZHANG Ming, ZHONG Sheng, LIN Yu

    School of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China

    ABSTRACT:  Objective  To compare the cytotoxicity of three kinds of dental restorative material, nano-composite resin Filtek Z350, compomer Dyract- AP and traditional composite resin TPH on cultured human pulp cell.  Methods  Human pulp cell were cultured by tissue culture from fresh dental pulp of teenagers, the effect of each material on viability of cultured cell was measured by MTT assay.  The adherence of human pulp cell to different material surface was observed under scanning electron microscope(SEM).  Results  The Filtek Z350 nano-composite resin showed the least cytotoxicity among three kinds of material tested(P<0.05).  Under SEM observation, pulp cells showed good adherence to all three kinds of material.  Conclusion  All these three kinds of dental restorative material have good biocompatibility and were biologically safe.  The cytotoxicity of Filtek Z350 nano-composite resin was the least among 3 materials tested.

    KEY WORDS:  composite resins; dental pulp; cytotoxicity; colorimetry; nitroblue tetrazolium; microscopy,electron,scanning

    随着纳米技术在口腔修复材料中的应用和发展,已在很大程度上改善了传统材料的性能［1-2］。Filtek Z350是一种将填料纳米化的复合树脂,经测试其耐磨性、抛光性等主要物理机械性能指标高于或相当于其他复合树脂［3］。笔者采用体外细胞培养技术和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定该材料和临床常用的两种牙体修复材料浸渍液对人牙髓细胞增殖情况的影响,扫描电镜观察人牙髓细胞在3种材料表面的生长贴附情况,评价该纳米复合树脂的生物安全性,为口腔医生在临床上正确、合理、科学的选择修复材料提供参考依据。

    1  材料与方法

    1.1  主要材料与仪器  Filtek Z350(美国明尼苏达矿业制造贸易有限公司),Dyract-AP复合体、TPH复合树脂(德国DENTSPLY DeTrey GmbH公司)。DMEM培养液(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Hyclone公司)。CO2培养箱(德国Heraeus公司),倒置相差显微镜(广州光学仪器厂),生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司),酶标仪(德国Human公司),扫描电镜(荷兰菲利普公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养和鉴定  选择因正畸需要或阻生原因而完整拔除的健康恒牙(患者10～25岁),拔出后立即置入含抗生素(青霉素100 U/mL,链霉素100 μg/mL)的DMEM培养液,超净工作台中取出牙髓,以本实验室的改良组织块培养法原代培养人牙髓成纤维细胞,当细胞生长至90%融合时消化传代。

    倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学法(SP法)对细胞爬片进行波形蛋白、角形蛋白染色鉴定细胞来源。取第5代人牙髓成纤维细胞用于实验。

    1.2.2  材料浸渍液制备  将3种实验材料按其操作说明书充填到直径5 mm、厚度2 mm圆柱状孔模具中,使用同一光固化灯(光照强度:1 300 mW/cm2 )光照固化,制备统一规格的材料块,经60Co照射灭菌后浸入含10% FCS的DMEM培养液中(材料块的表面积/培养液体积＝0.6 cm2/mL),于37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度条件浸泡120 h制备各材料浸渍液原液。

    1.2.3  分组和细胞毒性试验(MTT)法  将对数生长期的第4代人牙髓成纤维细胞消化,离心、弃上清液后加入无血清的培养液重悬,混匀后接种于96孔板,每孔200 μL含HPC 4 000个,于37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度条件下同步化培养24 h后吸弃无血清培养液,按实验分组设计换以相应培养液,放入培养箱中按前述条件继续培养。

    实验分组:(1)实验组为含材料浸渍液100%，50%，25%，12.5%的DMEM培养液；(2)阴性对照组为不含材料浸渍液的DMEM培养液；(3)阳性对照组为含0.64%苯酚的DMEM培养液（含苯酚的阳性对照组单独使用培养板,以避免苯酚挥发影响其他组细胞的增殖）；(4)空白对照组为不含细胞的DMEM培养液。按4个时间点共设4块平行板,每个实验小组5孔,另有一板为阳性对照组,共4组,每组5孔。换液培养后分别于第1,3,5,7天随机取出一块96孔板(阳性对照组随机取一组检测):每孔加入MTT 20 μL孵育4 h，吸除孔内液体,加DMOSE溶液150 μL放入培养箱10 min,取出后微振荡10 min使结晶充分溶解,于酶标仪490 nm波长测定每孔OD值,取5孔的平均值,用公式计算细胞相对增殖率(relative growth rate,RGR)并进行统计分析,按5级毒性分级法评价材料毒性［4］:

    RGR＝试验组OD-空白对照组OD   阴性对照组OD-空白对照组OD×100%

    1.2.4  扫描电镜观察  取前法制备好的实验材料块各5个,分别放入48孔板内,每孔加入2×104 mL-1的细胞悬液1 mL,37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度培养48 h,细胞固定液固定24 h,程序脱水,临界点干燥、喷金,扫描电镜观察人牙髓成纤维细胞在3种材料表面的生长情况。

    2  结  果

    2.1  原代细胞培养及细胞来源  人牙髓组织块接种后,牙髓成纤维细胞最早于第8天游出,在组织块周围呈成纤维细胞样游出,多为条梭形少量多角形,形态规整,细胞质丰满,细胞核仁清晰。约20 d左右牙髓成纤维细胞可铺满瓶底80%～90%。在倒置相差显微镜下观察培养的HPC形态上呈典型的成纤维样细胞,免疫组织化学显示细胞质中抗波形蛋白阳性,角蛋白呈阴形表达,证明所培养的细胞来源于中胚层的成纤维细胞(图1)。

    2.2  细胞毒性  各实验组第1,3,5,7天的细胞增殖曲线示100%及50%浓度组中,第1天和第3天3种材料D值均高于阴性对照组,第5天和第7天D值增加明显滞后于阴性对照组,甚至出现D值减小现象（图2）。高浓度组中,除第3天50%Dyract-AP及第7天100%TPH外，Filtek Z350各时间点D值均大于TPH和Dyract-AP(P<0.05)。25%组及12.5%组的增殖曲线几乎与阴性对照组重叠,Filtek Z350在各时间点D值大于TPH和Dyract-AP(P<0.05)。RGR毒性分级见表1。

    2.3  扫描电镜  各材料块表面都可见到牙髓成纤维细胞贴附生长,细胞形态未见明显不同,说明3种材料均具有良好的生物相容性(图3)。

    3  讨  论

    自Kawahara首次应用细胞培养法评价牙科材料的生物安全性以来,已有多种细胞毒性试验方法得到应用,其中以原代细胞进行细胞毒性试验已被公认为是鉴别、筛选具有良好生物相容性材料的一种方法［5-6］。与建系细胞相比,原代细胞因取自自体组织,作为材料毒性的靶细胞更为接近临床实际情况,结果也更为准确客观［7］。因此本试验选用原代培养的人牙髓成纤维细胞进行细胞毒性试验。

    常用的材料与细胞接触方式有直接接触、间接接触或通过材料浸渍液方式接触。直接接触法不仅 表1  对照组和各实验组RGR和毒性评级能直接检测材料的毒性,也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段［8］。浸渍液法的优点在于,材料浸渍液能与细胞有广泛且均匀的接触,可用于分析材料中溶出物的毒性,其结果与动物毒性试验结果吻合率高［9］。本实验同时选用直接接触和材料浸渍液两种接触方式,实验结果更为全面可靠。

    本实验选用临床上常用的光固化修复材料Dyract-AP、TPH与新型纳米复合树脂Filtek Z350进行细胞毒性比较。Dyract-AP属复合体修复材料,通常认为其细胞毒性较复合树脂低且对牙髓刺激性小,可直接用于中等深度活髓牙洞型充填；TPH复合树脂对牙髓组织刺激性较大,用于中等深度活髓牙洞型充填时必需进行垫底。本文发现,Filtek Z350几乎在不同浸渍液和不同时间点对人牙髓细胞的毒性都小于TPH 和Dyract-AP(P<0.05),而后两者之间并无明显差别。Dyract-AP是复合体材料，具有复合树脂和玻璃离子的优点,与TPH比较，对牙髓刺激性小且具有绝对的优势,而本文的体外细胞试验并未得到相应结果,这可能是由于Dyract-AP中含氟,固化后其氟离子的持续释放可在一定程度上影响细胞代谢,且体外实验缺乏应有的牙本质屏障,其细胞毒性也可能增强［10］。

    由于充填体在口腔内受牙本质屏障、光照强度、时间以及唾液冲刷等因素的影响,其所能溶解释放出的有毒物质并不能达到在实验中所模拟的高浓度组,考虑到口内实际情况和体外实验的差异,体外实验一般以25%浓度为标准组来评价材料的毒性情况。本实验设计了4个浓度组，从实验可看出,随着培养时间的增加,除了阳性对照组外几乎各组的OD值均相应增加,高浓度组增加迟缓,标准组和低浓度组增加迅速，与阴性对照组较为一致,几乎未受材料浸渍液的影响。实验第1天,3种材料的OD值高于阴性对照组,特别是100%浓度组,这可能是细胞接触到某种轻度化学刺激物时所表现出的一种自我保护防御反应,即由于材料的毒性杀伤作用并不强所致的促细胞增殖作用［4］。随后1～5天由于刺激物持续存在,细胞杀伤效应开始增强,各组增殖率呈下降趋势。此后,随时间延长,细胞开始耐受刺激物的轻微毒性,故各组细胞增殖率逐渐趋于平稳。本研究结果表明,3种材料在标准组和低浓度组的毒性评级均为0～1级,其中Filtek Z350为0级。此结果与扫描电镜观察到的直接接触法实验结果一致,说明3种材料都有良好的细胞相容性,均在生物安全的使用范围内。

    本研究发现,Filtek Z350在物理性能改善的同时,细胞毒性也明显低于临床常用的充填修复材料TPH和Dyract-AP。体外细胞毒性实验只是检测材料生物相容性的一个方面,对该材料的全面评价有赖于从细胞到动物实验结果的综合评价。

【参考文献】［1］ 陈 曦. 纳米复合树脂的研究进展［J］. 临床口腔医学杂志, 2003,19(12):754-755.

［2］ Terry D A. Direct applications of a nanocomposite resin system:Part 1-The evolution of contemporary composite materials［J］. Pract Proced Aesthet Dent, 2004,16(6):417-422.

［3］ Mitra S B,WU D,Holmes B N. An application of nanotechnology in advanced dental materials［J］. J Am Dent Assoc, 2003,134(10):1382-1390.

［4］ 张彩霞. 应用细胞培养法对复合树脂充填材料的细胞毒性研究［J］. 口腔医学, 1982,2(1):40-41.

［5］ Kawahara H,Shiota M,Yamakawa Y. Studies on the effects of dental metals upon the mesenchymal cell in tissue culture［J］. J Osaka Odont Soc, 1955,18(2):343-348.

［6］ 郝建军. 牙科材料的细胞毒性试验［J］. 牙体牙髓病学杂志,1997,7(2):135-137.

［7］ 刘晓亮. 体外细胞毒性试验评价牙科材料的现状及展望［J］. 口腔材料器械杂志, 1998,7(1):26-29.

［8］ 梁卫东. 细胞培养法评价生物材料生物相容性研究进展［J］. 生物医学工程学杂志, 1999,16(1):86-90.

［9］ Tsuchiya T. Study on the standardization of cytotoxicity tests and new standard reference materials useful for evaluating the safety of biomaterials［J］. J Biomater Appl, 1994,9(2):138-145.

［10］ Quinlan C A,Zisterer D M,Tipton K F,et al. In vitro cytotoxicity of a composite resin and compomer［J］. Int Endod J, 2002,35(1):47-55.