牙科抗菌磷酸锌黏固剂的制备及其抗菌性能的检测

    作者：张林祺，梁兰平，刘双云，杨聚才    作者单位：1.解放军第260医院口腔科 河北 石家庄 050041； 2.第四军医大学口腔医院检验科 陕西 西安 710032

    【摘要】  目的 探讨抗菌磷酸锌黏固剂的加工工艺及其抗菌性能。方法 采用研磨法将载银无机抗菌剂添加在磷酸锌黏固剂粉体中合成载银抗菌磷酸锌黏固剂。以普通磷酸锌黏固剂作为对照，进行大体观察和扫描电镜观察。然后通过细菌（变异链球菌、白假丝酵母菌、牙龈卟啉单胞菌）接种于抗菌磷酸锌黏固剂上，计算出样品的抗细菌率。结果 大体观察显示，抗菌磷酸锌黏固剂与普通磷酸锌黏固剂无明显差异。扫描电镜观察显示，抗菌磷酸锌黏固剂表面均匀散布Conval PAg-40颗粒。抗菌磷酸锌黏固剂对变异链球菌、白假丝酵母菌、牙龈卟啉单胞菌均有抗菌效果，且抗菌能力区别明显。结论 添加载银抗菌剂对磷酸锌黏固剂的表面结构无明显影响且具有一定的抗菌性。

    【关键词】  载银无机抗菌剂；　磷酸锌黏固剂；　加工工艺； 抗菌活性

    APreparation and determination of antibacterial activity of dental antibacterial zinc phosphate cement  ZHANG Lin-qi1, LIANG Lan-ping1,

    LIU Shuang-yun1, YANG Ju-cai2.

    （1. Dept. of Stomatology, No. 260 Hospital of PLA, Shijiazhuang 050041, China； 2. Dept. of Detection, Hospital of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China）

    [Abstract]  Objective 　To prepare and explore the antibacterial activity of dental antibacterial zinc phosphate cement（ZPC）． Methods  Silver base inorganic antibacterial agent（Conval PAg-40） was mixed into ZPC powder with mortar. To verify the process technique, the structure of antibacterial ZPC was observed grossly and scanned by electronic microscopy, and was compared with the common ZPC. Then inoculate quantitative oral pathogens（Streptococcus mutants, Saccharomyces albicans, Porphyromonas gingivalis） on zinc phosphate cement. Viable count in the samples was detected after cultured for a certain time and the antibacterial rate was figured out. Results  There was little difference between the antibacterial ZPC and the common ZPC. When observed by a scanning electronic microscope, Conval PAg-40 were well dispersed in ZPC and there were few air bubbles and crannies in the structure. Antibacterial ZPC had antibacterial effect to the pathogens and the antibacterial effects had significant difference. Conclusion　 There is little influence on surface structure of the ZPC. The ZPC which added silver based inorganic antibacterial agents has determinate antibacterial activity．

    [Key words]  silver base inorganic antibacterial agents； zinc phosphate cement； process techniques； antibacterial activity

    　    牙科磷酸锌黏固剂，常用于冠、桥粘接修复。但临床上发现牙科磷酸锌黏固剂易形成继发龋而导致修复失败，其形成的原因主要是由于其粘接后形成较大微渗漏，致龋细菌在其表面滞留所致[1]。载银抗菌剂是近年来研发的新型抗菌剂，既往研究表明其对多种口腔病原菌有较好的抗菌效果[2]，可添加在树脂等材料中抑制口腔病原菌的定植[3-4]。本研究将载银无机抗菌剂添加在磷酸锌黏固剂中制成抗菌磷酸锌黏固剂，并探讨其加工工艺的可行性，同时对其抗菌性能进行检测。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料和仪器

    1.1.1  实验材料  载银无机抗菌剂Conval PAg-40（西安康旺抗菌科技股份有限公司），载体为磷酸锆。普通磷酸锌黏固剂（上海齿科材料厂），其粉液比例为1.0 g/0.5 mL。

    1.1.2  实验菌株  本实验检测菌株分别是变异链球菌（ATCC 25175）、白假丝酵母菌（ATCC 25261）、牙龈卟啉单胞菌（ATCC 33277），均为国际标准菌株，来自第四军医大学口腔医院检验科。

    1.1.3  实验器材  BP-190S电子天平（德国赛多利斯公司），5 000 μL微量取药器（上海大龙医疗器械设备有限公司），玛瑙乳钵（辽宁省玛瑙工艺厂），Quanta200扫描电镜（FEI公司，美国）。超净工作台（上海净化设备厂），DY－1型培养箱（浙江义乌冷冻机械厂），微量加样器（Nichikyo公司，日本），Vitek细菌比浊仪（法国生物梅里埃公司），96孔微量板（Nunc公司，丹麦），胰酪胨大豆肉汤（trypticase soya broth，TSB；上海美季生物技术有限公司），细菌胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂（trypticase soya agar，TSA）平板（Genmed公司，美国）。

    1.2  方法

    1.2.1  载银抗菌磷酸锌黏固剂加工工艺  将载银无机抗菌剂Conval PAg-40按一定质量比添加在磷酸锌黏固剂中，置于乳钵中研磨10 min制成抗菌粉体。然后按粉液比例1.0 g/0.5 mL调拌混匀，置于特制模具中制成实验所需的试件。试件为正方形，边长10 mm，厚度2 mm。

    1.2.2  载银抗菌磷酸锌黏固剂观察  按Conval PAg-40在黏固剂中的含量不同制作实验组试件

    4组，每组4块试件，即4组实验组试件分别含0.5%CV、1.0%CV、1.5%CV和2.0%CV抗菌剂。用普通磷酸锌黏固剂制作对照组试件2组，即空白对照组和阳性对照组，每组各4块试件，其尺寸同实验组试件。空白组试件中不含抗菌剂。阳性对照组试件为普通磷酸锌黏固剂中加入0.12%氯己定溶液使氯己定的含量达到2.0%CV。实验组和空白组从大体上观察其色、形、质的差异，并以扫描电镜观察其表面结构的差异。

    1.2.3  抗菌实验  1）实验菌液的配制：将实验菌株置TSA平板上传代培养18 h后，挑取琼脂表面单个菌落混悬于TSB培养液中。用Vitek细菌比浊仪配置成浓度为1×105 cfu/mL的菌液。2）制备聚乙烯薄膜，为正方形，其边长为10 mm，厚度为0.10 mm。将聚乙烯薄膜用70%乙醇溶液浸泡1 min，再用无菌水冲洗，自然干燥。3）抗细菌率的测定：取菌液50 μL铺在薄膜表面，保证薄膜菌浓度不变。

    用灭菌镊子夹起带菌薄膜分别覆盖在实验试件和空白对照试件上，一定要铺平，使菌均匀接触样品，置于灭菌平皿中，在（37±1） ℃、相对湿度大于90％的条件下培养24 h。取出培养24 h的样品，分别加入20 mL洗脱液（含0.80% NaCl的生理盐水），反复冲洗薄膜，充分摇匀后，取一定量接种于营养琼脂培养基NA（nutrient agar）中，在（37±1） ℃下培养24～48 h后活菌计数，测定活菌数，计算抗细菌率，抗细菌率计算公式为：抗细菌率=（每片空白对照样品平均回收细菌数－每片抗菌材料样品平均回收细菌数）/每片抗菌材料样品平均回收细菌数×100%。以上实验重复两次。 

    2  结果

    2.1  大体观察结果　

    所有试件常温下调拌完全固化后，实验组试件色泽均匀、表面光泽细致，与空白组相比，除颜色略偏白外无明显差异。

    2.2  扫描电镜观察结果　

    放大倍数为3 000时可观察到：空白组表面结构均匀，颗粒相对较少；实验组颗粒相对较多，表面见有约1.5 μm的Conval PAg-40颗粒均匀散布。放大倍数为500时观察到：空白组表面结构相对松散，有小气泡；实验组表面结构更为致密均匀，散布细小抗菌剂颗粒，有小气泡。气泡的出现与加工方法有关。

    2.3  抗菌实验结果  

    抗菌实验结果见表1。

    采用SPSS 10.0统计软件对实验组与阳性对照组以及实验组之间进行方差分析和t检验，发现对于变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌来说，除了实验组0.5%CV和阳性对照组之间差别无统计学意义外，含有不同比例抗菌剂的磷酸锌黏固剂抗菌性能的差异具有统计学意义（P<0.05）；而对于白假丝酵母菌来说，除了实验组2.0%CV与阳性对照组结果之间的差异无统计学意义外，含有不同比例抗菌剂的磷酸锌黏固剂抗菌性能的差异具有统计学意义（P<0.05）。随着抗菌剂比例的不断

    增加，抗菌磷酸锌黏固剂的抗细菌率也不断提高。因此，抗菌磷酸锌黏固剂具有一定的抗菌性能。

    3  讨论

    抗菌材料是近年来国际上新兴的与人类健康发展、环境保护等密切相关的生态环境材料。最先研究的有机抗菌材料具有短期高效杀菌效果，但安全性和化学稳定性差，易产生微生物耐药性，尤其耐热性差（小于200 ℃）是其最大的弱点，导致它在应用中不适应高温加工，高温分解产物甚至有毒。20世纪80年代研究出的无机抗菌材料无毒、广谱抗菌、抗菌时效长、不产生耐药性，特别是有突出的耐热性（600～1 000 ℃），大大拓宽了抗菌材料的应用领域[5-6]。

    经过学者们多年来不懈努力，已经证实载银抗菌剂对常见的口腔致病菌有高效的抑菌效果。佘文珺等[7-8]通过比较6种载银抗菌剂对口腔常见致病菌的抗菌活性，证实载银抗菌剂对变异链球菌、黏性放线菌、乳酸杆菌、白假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等都有明显的杀菌效果。张林祺等[9-10]将载银无机抗菌剂添加到复合树脂中固化后观察其抗压强度、弯曲强度和耐磨性能都未发生明显改变。Yoshida等[11]报道，含5%银-磷酸锆和7%银-硅胶的树脂试件对变异链球菌有抑制作用。

    普通磷酸锌黏固剂由两部分组成，即粉剂和液剂。本实验采用研磨法混合，试件的制备参考了以往的研究和国内的有关行业标准。固化后的磷酸锌黏固剂是固体，所以一般的抗菌实验无法进行检测。本实验选用的方法为贴膜法，所有操作步骤和规则均参照2003年制定了国家标准QB/T 2591-2003（《抗菌塑料——抗菌性能实验方法和抗菌效果》），它是目前抗菌材料方面的唯一行业标准，具有权威性。

    本实验结果表明，添加纳米载银无机抗菌剂对磷酸锌黏固剂的表面结构没有明显影响。这可能与抗菌剂的粒度有关，因为该抗菌剂粒度均匀，约为1.5 μm，与磷酸锌黏固剂混合后，增加了超微无机填料的含量以及填料分布的均一性。载银无机抗菌剂Conval PAg-40可与磷酸锌黏固剂结合，对其结构无明显影响，且适当比例的抗菌剂添加在黏固剂中具有一定的抗菌性能。由此说明该加工工艺确实可行、操作简便、分散效果良好、不会影响临床应用，而且使牙科磷酸锌黏固剂具有抗菌性，使牙科磷酸锌黏固剂能够长期广泛的作为修复材料应用于口腔科，具有一定的意义。但是本实验设计是在离体环境下进行，在口腔环境下的抗菌性能还有待进一步研究。

【参考文献】[1] 李灏来, 刘 丹, 毕小琴, 等． 调拌方法对磷酸锌黏固剂材料抗压强度的影响[J]． 华西口腔医学杂志, 2008,26（2）：172-174.

[2] 方 明, 陈吉华, 徐修礼． 不同种类无机抗菌剂对口腔致病菌抗菌性能比较及其检测方法探讨[J]． 口腔医学研究, 2006, 22（1）：13-14.

[3] 余日月, 周永胜, 冯海兰. 纳米载银树脂基托的体外抗菌效果[J]. 实用口腔医学杂志, 2005, 21（5）：670-672.

[4] 佘文珺, 胡 滨, 张富强． 纳米载银无机抗菌剂对义齿基托树脂抗菌性能的影响[J]． 上海交通大学学报（医学版）, 2006, 26（10）：1096-1098.

[5] Ohashi S, Saku S, Yamamoto K. Antibacterial activity of silver inorganic agent YDA filler[J]. J Oral Rehabil, 2004, 31（4）：364-367.

[6] Kawahara K, Tsuruda K, Morishita M, et al. Antibacterial effect of silver-zeolite on oral bacteria under anaerobic conditions[J]. Dent Mater, 2000, 16（6）：452-455.

[7] 佘文珺, 张富强. 6种纳米级载银无机抗菌剂对口腔病原菌的抗菌活性比较[J]. 上海口腔医学, 2003, 12（4）：356－358.

[8] 刘 奕, 陈吉华, 方 明, 等. 添加抗菌剂的藻酸盐印模材料抗菌性能的实验[J]. 口腔医学研究, 2005, 21（6）：652-654.

[9] 张林祺, 高 勃, 唐立辉, 等． 纳米载银无机抗菌剂对复合树脂机械强度的影响[J]． 上海口腔医学, 2006, 15（1）：73－76.

[10] 张林祺, 马 钢. 三种纳米级载银无机抗菌剂对常见致龋菌的抗菌活性比较[J]． 现代口腔医学杂志, 2007, 16（5）：191－193.

[11] Yoshida K, Tanagawa M, Matsumoto S, et al. Antibacterial ctivity of resin composites with silver-containing materials[J]. Eur J Oral Sci, 1999, 107（4）：290-296.