癌基因c-fos,c-jun在口腔鳞癌的表达研究

作者：郑明　张伟 汤晓飞 刘敬华

【关键词】  免疫组织化学

　　［摘要］  目的：检测癌基因c-fos、c-jun在口腔鳞癌、癌旁黏膜的表达，探讨其与口腔鳞癌发生发展的关系。方法：采用免疫组化S-P法对正常口腔黏膜、口腔鳞癌及癌旁黏膜中c-fos、c-jun的表达情况进行检测。结果：c-fos、c-jun在正常口腔黏膜不表达，在口腔鳞癌及癌旁黏膜表达较强， c-fos、c-jun的表达水平与癌组织的分化程度有关(P<0.05)。结论：c-fos、c-jun的表达水平可作为判定口腔鳞癌分化的指标，c-fos、c-jun可作为口腔黏膜早期癌变和口腔鳞癌的生物学标记物。

　　Study and Expression of Oncogene c-fos,c-jun in Oral Squamous Cell Carcinoma.

　　ZHENG Ming, ZHANG Wei, TANG Xiao-fei, et al.

　　Hospital of Stomotology, Jilin University, Changchun 130041

　　［Abstract］Objective: To investigate the expression of c-fos,c-jun oncogene product in OSCC,para-OSCC and it’s role in the occurrence and development of OSCC. Methods: We employed immunohistochemical S-P method to investigate the expression of c-fos,c-jun in  OSCC and  para-OSCC,and compared to normal tissues. Results: There was no expression of c-fos,c-jun in normal oral mucosa. There was significant overexpression of c-fos,c-jun in OSCC and para-OSCC. In OSCC ,the expression degree of c-fos,c-jun was related to different differentiation (P<0.05). Conclusions: c-fos, c-jun could be an index to different OSCC. And it could be regarded as the biological marker of oral mucosa's intial cancer and OSCC.

　　［Key words］  c-fos  c-jun  Immunohistochemistry  Oral squamous cell cacinoma(OSCC)

    口腔癌是我国发病率较高的癌症之一，口腔鳞癌约占口腔恶性肿瘤的90%，早期发现或明确其恶性程度，采取相应的治疗方案，对于疾病的预后及提高生存率都有着重要的意义。c-fos、c-jun属于核内癌基因，它们是早期的转录活化因子，近来认为Fos、Jun蛋白是转录水平上不同信号传递的“中转站”，可与不同类别的转录因子及核受体相互作用［1］。目前，有关c-fos、c-jun在口腔鳞癌中的表达情况在国内外还未见报道。本研究采用免疫组织化学S-P法研究Fos、Jun蛋白在口腔鳞癌、癌旁黏膜中的表达情况，从而揭示c-fos、c-jun在口腔鳞癌发生发展中的作用及意义，为口腔鳞癌的早期临床诊断、治疗及预后的判定提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本来源  本实验所用10例正常口腔黏膜、31例口腔鳞癌组织均为1999~2000年间，本院颌面外科手术中切除的标本，癌旁黏膜为距癌组织1 cm范围以内的组织，经固定、脱水后制成蜡块。以PBS作空白对照，以正常山羊血清为替代对照，以已知的c-fos、c-jun阳性表达的食管癌切片为阳性对照。

　　1.2  主要试剂及方法  c-fos、c-jun多克隆抗体，工作浓度为1∶100，DAB、S-P试剂盒，均购自北京中山生物科技有限公司。采用免疫组织化学S-P法染色。

　　1.3  结果判定  定性：以细胞膜或细胞浆或细胞核呈棕褐色着色的细胞为阳性细胞。定量：图象分析法分析。采用Luzex-F图像分析仪及改良的软件系统。每张切片在40倍镜下随机选取5个不相重叠的区域。经测量可获得平均灰度A，及阳性区域/全部区域比值Pwarea。统计学处理：率的比较用X2检验，均数的比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  c-fos表达的分布、定位与阳性率  c-fos在正常口腔黏膜上皮无阳性表达，在口腔鳞癌中，其阳

　表1  c-fos、c-jun的表达与口腔鳞癌分化程度的关系　略

　　图1  c-fos在高分化口腔鳞癌中的阳性表达　略

　　图2  c-jun在高分化口腔鳞癌中的阳性表达　略

　　2.2  c-jun表达的分布，定位与阳性率  c-jun在正常口腔黏膜上皮无阳性表达，在口腔鳞癌中其阳性表达多数位于癌巢中各层细胞，少数仅位于癌巢中的棘细胞，阳性表达多数定位于细胞浆，见图2。呈弥漫性分布，细胞膜或细胞核也可见阳性表达。在癌旁黏膜上皮中，c-jun阳性表达主要位于基底细胞和棘细胞，角化细胞也可见阳性表达，定位于细胞核，它也可表达于癌旁间质中腺管上皮细胞。由表1可见，随着肿瘤分化程度的降低，c-fos，c-jun的阳性表达率、染色强度、染色范围均降低，差异有显著性（P<0.05），见表1。

　　2.3  c-fos、c-jun二者在口腔鳞癌中表达的关系 同一口腔鳞癌病例中c-fos和c-jun的表达协同性较强，二者同时阳性有14例（45.2%）同时阴性12例(38.7%)，c-fos阳性、c-jun阴性3例（9.6%）,c-fos阴性、c-jun阳性2例（6.5%）。c-fos和c-jun在口腔鳞癌中的表达水平呈正相关（r=0.739）。

　　3  讨论

    肿瘤是人类死亡的最主要病因之一，而原癌基因的激活和抑癌基因的失活已被公认为是人体恶性肿瘤发生的主要原因。c-fos、c-jun属于转录因子类的原癌基因。c-fos基因由5个外显子组成，表达产物Fos由381个氨基酸组成，分子量为55KD，Fos本身不能形成二聚体、它只能与Jun形成异二聚体（AP-1）。c-jun基因的阅读框架有340个氨基酸，其蛋白产物Jun为37-39KD的蛋白，Jun可以形成同源二聚体，但更多的是形成AP-1。癌基因c-fos、c-jun编码的蛋白质具有亮氨酸拉链。Fos、Jun、AP-1都具有拉链旁的DNA结合区，都具有共同序列TGA（C/G）TCA，它们的转录激活区都具有负电性的特征及a螺旋的结构特征，故人们普遍认为它们有共同作用对象或靶蛋白［2］。

    在本次实验中，c-fos、c-jun在正常口腔黏膜不表达，在口腔鳞癌和癌旁组织中高度表达，表明癌基因c-fos、c-jun与口腔鳞癌的发生、发展有着密切的关系。有人指出癌基因c-fos、c-jun在细胞生长的静止期基本不表达，已有文献报道c-fos的过度表达可见于人的乳腺癌、结肠癌、胃癌，鼠的肝癌及癌前病变［3］。c-jun的过度表达可导致鸡胚胎成纤维细胞和鼠1-A细胞恶性转化。 c-fos、c-jun在癌旁黏膜上皮的高表达，说明其表达先于形态出现。它们在高分化的口腔鳞癌的表达水平明显高于低分化口腔鳞癌，具此推测c-fos、c-jun主要在口腔鳞癌的形成早期起作用，是一个早期的分子事件。有研究表明c-fos、c-jun作为早期反应基因，在外界剌激后1 h内，其转录水平（mRNA）就明显增高，这一点是许多其它基因无法比拟的。多种刺激因素，如各种生长因子、佛波酯、血清、电离辐射皆可诱导正常细胞内c-fos、c-jun的表达，现已证实血小板源生长因子及佛波酯促癌剂都是通过活化TPK及PKC，来活化c-fos的转录［4］。这表明外在致癌因素通过影响转录因子，从而调节其他基因的表达。

    本实验结果显示c-fos主要表达于癌巢中的基底细胞，c-fos、c-jun均可表达于癌旁黏膜的基底细胞和腺管上皮细胞，这些细胞都是增殖速度快的细胞，由此可推论：口腔鳞癌起源于鳞状上皮的基底细胞，c-fos、c-jun是通过促使细胞增殖从而导致口腔鳞癌的形成。国外学者曾推测：c-fos的转录活化会产生一种初期的发育信号，可能启动细胞DNA的复制和细胞的分裂，c-fos可能在整个细胞周期持续表达，抑制细胞进入静止期，使细胞获得"永生性"不断增殖。但也有人认为c-fos仅仅对细胞从G0期进入G1期起决定性的作用。国内学者在金黄地鼠颊囊癌变动物模型中也检测到c-fos的高表达，并认为这是鳞癌发生的早期事件［5］。我们认为c-fos不仅启动细胞的增殖，而且它对迟反应基因的活化促使细胞由G1期向S期转变，近年来Betta等人的实验研究也证实了这一点［6］。由此，我们推测c-fos在细胞向恶性转化过程中早期的持续表达水平可能是决定口腔鳞癌恶性程度的关键。c-fos不仅对细胞增殖起重要作用，它也调节细胞的分化，已有实验证实外源性c-fos基因可引导细胞分化，体外培养的F9EC（畸胎瘤干细胞）不能自发分化，用DNA转染将外源性c-fos引入F9EC，可诱导其分化。另外国外有人用c-fos基因转染大鼠3Y1细胞，加强了瘤细胞的运动性、侵袭性与肺转移能力，表明c-fos 基因可能参与肿瘤细胞的浸润和转移表型的发生。

 c-jun可在口腔鳞癌癌巢中各层细胞表达，在癌旁黏膜中基底细胞、棘细胞和角化细胞，癌旁间质中腺管上皮细胞表达，说明其参与口腔鳞癌的增殖与分化。本次实验中c-fos与c-jun的共同阳性率为45.2%，共同阴性率为38.7%，说明c-fos、c-jun在口腔鳞癌的发展中具有协同作用，虽然它们也可单独表达。c-fos与c-jun在口腔鳞癌中的表达水平呈正相关，说明c-jun的转录活化被它与c-fos的产物作用而增强，因此，我们推测c-jun对口腔鳞癌的增殖作用是通过与c-fos的产物形成AP-1而增强的。近年的研究表明，Jun蛋白与AP-1有相同的四条肽链，它们无论从抗原性还是生化特性都很类似。AP-1比Jun-Jun同源二聚体能更广泛作用于DNA序列，调控转录，此种作用方式可能具有普遍意义。另外下列研究结果也支持c-jun对增殖的协同作用：国外有人通过在乳腺癌中的实验认为，Jun蛋白可能是Ha-ras转化的媒介，而ras主要与细胞增殖控制有关，c-jun作为转录因子，不论是它的合成还是活化都被ras的表达所刺激。也有研究显示当c-jun与c-Ha-ras一起活化时，c-jun在体外恶性转化鼠胚胎成纤维细胞的能力增强。突变的ras的半衰期比野生型要长得多，胞浆中大量积累的突变的ras，导致通过蛋白激酶细胞旁路活化。因此，c-jun初期的活化可通过ras突变来维持其转录，这点可被Jun、Ras在结肠癌中的协同表达所证实［7］。

    Jun蛋白还能与cAmp激活的转录因子（CREB）家族中的某些成员形成二聚体，此二聚体能先与CRE位点结合，提示c-jun参与了不同信号传递途径。

    本次实验中，c-fos、c-jun不仅在细胞核上表达，在细胞膜、细胞浆也见其表达，直观上似乎与其作为核内蛋白产物相矛盾。国外文献表明c-fos、c-jun在新鲜冰冻的组织中阳性表达仅限于细胞核，而用福尔马林液固定、石蜡包埋的组织则不仅在细胞核中表达，而且在细胞膜、细胞浆都表达［8］。我们认为这种现象可能是由于组织离体时间长，或固定液、脱水、包埋等环节导致核膜破裂，使核内蛋白质弥散于细胞浆所致。

　　4  结论

    c-fos、c-jun的过度表达，可发生于口腔鳞癌组织和癌旁黏膜，它可做为一种口腔黏膜早期癌变和口腔鳞癌的生物学标记物。c-fos、c-jun在高分化口腔鳞癌中的表达水平均明显高于中、低分化口腔鳞癌，它们的表达水平在临床上可做为判定口腔鳞癌分化的指标。c-fos主要是通过促进增殖参与口腔鳞癌的形成，与c-jun起协同增殖作用，并参与分化和信号传递。

　　参考文献

　　［1］  姜琨，童坦君.fos与jun癌基因产物的结构特点及其转录调控作用的研究进展［J］.生物化与生物物理进展，1992，19（4）∶254-258

　　［2］  Kanen Lech.Kate Andeson,and Koger Brent. DNA-bound fos proteins activate transcription in yeast ［J］. Cell, 1988, 52∶179-184

　　［3］  I.J,Magrisso,R.E.Richmond,et al.Immunohistochemical detection of Jun.Fos,and P53 oncoprotein expression in human colorectal oade-nomas and carcinomas ［J］. Nature, 1990, 265∶3 045-3 048

　　［4］  Richard Tarner and Robert Tjian. Leucine repeats and an adjacent DNA bindng domain mediate the formation of functional cFos-cJun heterodimers ［J］. Science, 1989, 243∶1 689-1 694

　　［5］  高文信,刘岩,孙淑芬,等.金黄地鼠颊囊癌变过程中c-fos和HSP70的表达［J］.口腔医学研究,2004,20(1)∶56-59

　　［6］  Betta, Aileen J Anderson. Increased immunoreactivity for jun and fos rel-ated proteins in Alzheimer`s disease:association with pathology ［J］. Science, 1988, 134∶1 087-1 094

      ［7］  Distel, RJ Ro, HS. Nucleoprotein complexes that regulate gene expr-ession in adipocyte differentiation: direct participation of c-fos ［J］. Cell， 1985, 49∶835-844

　　［8］  Condorellj, DFL. Kacizmarek.Induction of protooncogene fos by ext-racelluar signal in primary glial cell cultures ［J］. J Neurosci Res, 1989, 23∶234-239

　　作者简介  郑明（1970~ ），男，吉林长春人，主治医师，在读博士，主要从事口腔颌面外科临床及基础的研究工作。