3种根尖倒充填材料对人牙周膜细胞生长及超微结构的影响

　　作者：陈岗 孙卫斌　叶莺

　　【关键词】  根尖倒充填材料

　　［摘要］  目的：观察3种根尖倒充填材料对人牙周膜细胞生长及超微结构的影响，从而指导材料的选择。方法：用材料直接接触细胞并计数以及透射电镜观察细胞结构变化。结果：3种材料接触培养后细胞生长速度减缓，3种材料之间差异有显著意义,细胞内超微结构显示内质网,线粒体等细胞器及细胞核的结构均有改变。结论：本实验的3种根尖倒充填材料对牙周膜细胞均有毒性作用，其中光固化复合树脂和银汞合金毒性较强，而化学固化玻璃离子粘固剂毒性较弱，临床使用较好。

　　［关键词］  根尖倒充填材料  人牙周膜细胞  超微结构

　　Effects of Three Root-end Filling Materials on the Proliferation and Ultra-structure of HPDLC.

　　CHEN Gang, SUN Wei-bin, YE ying.

　　School of Stomatology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029

　　［Abstract］Objective: To evaluate the effects of three root-end filling materials on the proliferation and the ultra-structure of human periodontal ligament cell (HPDLC) . Methods: HPDLC were cultured with three materials directly. The number of cells was calculated and structure was observed by transmission electrical microscope (TEM). Results: The proliferation rates of cells cultured with three root-end filling materials directly decreased. The numer of endoplasms decreased, and the structure of mitochondria and nuclei changed. Conclusions: From this experiment, all of the three root-end filling materials are cytotoxic to HPDLC, among which amalgam and light curing composite resins are stronger than GIC.

　　［Key words］  Root-end filling materials  Human Periodontal Ligament Cell  Ultra-structure

    牙周膜细胞(periodontal ligament cell，PDLC)是牙周膜中最多,功能上也是最重要的细胞［1］，是人牙周膜组织中的主要间质细胞，不仅具有合成胶原、基质、弹力纤维和糖蛋白的功能，还有吸收胶原、吞噬异物的能力，在牙周组织的生理和病理中起重要作用［2］。在口腔临床根尖周病和牙周病治疗的预后观察指标中,牙周组织的愈合方式是一项重要指标。根尖周愈合有5种基本形式，主要是由牙周膜组织合成胶原以及发育为成骨细胞和成牙骨质细胞进行修复的。在根尖倒充填术中,材料与根尖周组织直接接触，从而对根尖周的愈合有较大的影响。

    目前，临床上所用的根尖倒充填材料有很多。本文通过体外人牙周膜细胞（ human periodontal ligament cell，HPDLC）培养，用3种根尖倒充填材料（银汞合金，光固化复合树脂，玻璃离子粘固剂）直接接触细胞，来观察它们对HPDLC生长及内部超微结构的影响，从而进一步探讨这3种根尖倒充填材料在根尖周组织愈合中的作用，为寻找更合适的根尖倒充填材料提供参考。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  银汞合金（北京，安泰科技股份有限公司）、光固化复合树脂（Heraeus Kulzer Dental Ltd）、化学固化玻璃离子粘固剂（SHOFU INC.KYOTO JAPAN）。按说明调制新鲜的银汞合金，光固化复合树脂，化学固化玻璃离子粘固剂，制成d=3 mm，h=3 mm的短柱状试样［3］，用洗涤剂自来水反复洗涤，三蒸水清洗，用双面贴固定于盖玻片上,超净台上紫外灯照射双面4 h，备用。

　　1.2  细胞培养  取临床因正畸需要或阻生拔除的无龋病，牙周病，根尖周病的健康前磨牙或阻生牙，9~29岁，拔牙后立即用生理盐水反复冲洗根部，移至超净台内，再以加双抗的RPMI1640液冲洗两次，刮取根中2/3的牙周膜组织，用组织块贴壁法进行原代培养，培养条件（37 ℃，100%湿度， 5% CO2+95%O2），原代细胞生长至第3代，作细胞爬片，用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，以证明细胞来源，取第6代细胞用于实验。

　　1.3  实验分组  第1组：银汞合金（Ag-Hg）；第2组：光固化复合树脂（LCR）；第3组：化学固化玻璃离子粘固剂（GIC）；第4组：阴性对照(标准培养液即RP1640+10%FBS的全培养液)，每组3个复孔。每组均分2个时间段进行测定：分别培养5 d、7 d。

　　1.4  检测  将用双面贴固定于盖玻片上的材料按以上分组放入24孔板中，每组3个复孔，共12孔/板，准备3块板。

　　1.4.1  细胞计数  将第6代长满瓶底的PDLC用0.25%胰酶消化成终浓度为5×104/mL的单个细胞悬液， 以1 mL/孔接种至3块24孔板，标准条件培养24 h；吸去各孔培养液，分组加标准培养液，一块板培养5 d，一块板培养7 d，隔天换一次液，分别在第5天，第7天进行细胞计数，记录。

　　1.4.2  透射电镜观察  第3块板培养到第五天时用细胞刮刮取细胞，移入10 mL尖底离心管加4 ℃预冷的PBS至10 mL，吸管吹打均匀，2 000 r/min离心15 min，弃上清，加4 ℃预冷的2%戊二醛4 mL固定2 h，剥离细胞团块移入青霉素小瓶，PBS漂洗3次，10 min/次。1% OsO4在4 ℃固定2 h，PBS漂洗3次，系列乙醇脱水、浸透、包埋、修块、切片、电子染色、透射电镜观察细胞超微结构、照相。

　　1.5  资料统计  数据以均数±标准差表示，以SPSS10.0统计软件处理数据，多组间比较用单因素方差分析，P<0.05为有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  HPDLC原代细胞培养及鉴定  组织块24 h后贴壁，大约在10~20 d时有细胞从组织块边缘游离出来，之后7天左右长满瓶底。细胞呈长梭形,胞浆丰富均匀。传代后7天左右长满瓶底。免疫组化鉴定结果为波丝蛋白阳性，角蛋白阴性，证明细胞来源于中胚层。

　　表1  3种材料对HPDLC生长的影响方差分析结果　略

　　2.2  不同材料与细胞接触培养各时间段细胞计数统计分析见表1、表2、表3、图1。各材料组与阴性对照组比较，用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，5 d、7 d均为P<0.05，有显著的统计学意义，认为这3种材料对HPDLC的生长都有抑制作用。

　　表2  各材料组之间两两比较的Post Hoc检验P值表（略）

　　表3  各材料组之间两两比较的Post Hoc检验P值表（略）

　　图1  3种根尖倒充材料对HPDL细胞生长的影响（略）

　　图2  －  图3  略

　　而各材料组之间两两比较的Post Hoc检验结果，5天组中，光固化复合树脂组与其余3组的P<0.01，有显著的统计学意义；7天组中，银汞合金组与光固化复合树脂组以及银汞合金组与化学固化玻璃离子组的P>0.05，无统计学意义，光固化复合树脂组与化学固化玻璃离子组的P<0.05，有统计学意义，其余均为P<0.01,有显著的统计学意义，因而认为三者中光固化复合树脂组对HPDLC的生长抑制作用最强，化学固化玻璃离子粘固剂明显优于其余二者。

　　2.3  透射电镜观察细胞超微结构见图2~图5。

　　图4  －  图5  略

　　3  讨论

    离体培养细胞具有活力好、层次薄和易于取材的特点，用固定剂处理时很容易穿透细胞并最大限度保存细胞生活状态下的超微结构，而超微结构在一定程度上可反映细胞的功能。因此可以借助电子显微镜观察细胞的超微结构，研究其功能。透射电镜下可观察到线粒体、粗面内质网、核糖体、细胞核等的变化。线粒体是细胞有氧呼吸的基地和供能场所，粗面内质网是合成内源性蛋白质的基地［4］。因此，这两种结构的破坏是导致细胞无法生存的原因。一般说来，细胞代谢活动越活跃，所包含的线粒体数目就越多，线粒体内膜和嵴的面积就越大［5］。细胞核是细胞功能及细胞代谢、生长、增殖、分化的控制中心。当细胞处于功能活跃状态时，胞核变大，核质比缩小,常染色质区域增大［6］。生长迅速的细胞可见核仁边集(核仁移至核膜处)。

    本实验结果在透射电镜下观察到，银汞合金组和光固化复合树脂组在细胞超微结构方面有较明显的改变，如粗面内质网减少、破坏，提示合成蛋白质能力降低；平滑型内质网增多，是细胞对毒性物质的应激反应，具有一定的解毒功能；线粒体髓鞘样变，内膜面积减小，细胞的代谢功能减缓；胞核形态不规则，核膜畸变，染色质异常分布，表明细胞分裂、增殖减弱。而化学固化玻璃离子粘固剂组细胞内细胞器基本呈正常结构，与对照组相似。因此认为银汞合金与光固化复合树脂对HPDLC增殖的抑制作用较大，最小为化学固化玻璃离子粘固剂。

    材料直接与培养细胞接触，可较大程度模拟口腔内条件，溶解释放物对生物体的毒性作用反映了固体材料的细胞毒性。因此本法能较准确地反映材料对HPDLC增殖的影响。Zhu等［3］曾报道，将新鲜调制的几种根尖充填材料填入无毒塑料试管，再置入细胞培养板内进行HPDLC细胞培养，分别在3 d、7 d进行细胞计数以及观察材料周围的乏细胞区，研究结果认为银汞合金对HPDLC有较强的细胞毒性，本实验结果一致。

    银汞合金的毒性可能来源于它的溶出物中含汞、银和铜，有的还有锌的溶出。复合树脂的固化过程是单体向聚合物转化的过程，随着时间的延长，残留单体减少，1 d后转化率达90%以上。完全聚合的复合树脂对机体无毒性，而残留单体的溶出则会产生一定的生物学毒性。通过本实验研究，笔者建议临床进行根尖倒充填手术时，使用化学固化的玻璃离子粘固剂。

　　参考文献

　　［1］  Arceo N, Sauk JJ, Moehring J, et al. Human periodontal cells initiate mineral-like nodules in vitro ［J］. J Periodontol, 1991, 62(8)∶499-503

　　［2］  Hoang AM, Chen D, Oates TW, et al. Development and characterization of a transformed human periodontal ligament cell line ［J］. J periodontal, 1997,68(11)∶1 054-1 062

　　［3］  Zhu Q,Safavi KE,Spangberg LSW: Cytotoxic evaluation of root-end filling materials in cultures of human osteoblast-like cells and periodontal ligament cells ［J］. J Endod, 1999, 25(6)∶410-412

　　［4］  谭曾鲁，周霞丽.医学细胞生物学［M］.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社，1992,116-121,155-166

　　［5］  陈诗书，汤雷明.医学细胞与分子生物学［M］.上海：上海医科大学出版社，1995,185-189

　　［6］  Blom S, Holmstrup, debelsteen E.A comparison of the effect of epidermal growth factor, and fibroblast growth factor on rat periodontal ligament fibroblast-like cells'DNA synthesis and morphology ［J］. J Periodontol, 1994,65∶373-378