正畸牙齿移动过程中大鼠三叉神经节PPTA mRNA表达变化

作者：孙应明　罗颂椒　赵昱辉 

［摘要］  目的：观察正畸牙齿移动不同时期大鼠三叉神经节PPTA mRNA表达变化。方法：采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测正畸加力和撤力后不同时期大鼠三叉神经节PPTA mRNA水平的变化情况。结果：加力后2 h大鼠三叉神经节PPTA mRNA的表达量开始增加，加力8 h至加力3 d达到最高，至撤力后2~4周PPTA mRNA的表达量开始下降，但 PPTA mRNA水平仍然明显高于对照组。结论：正畸牙齿移动过程中大鼠三叉神经节PPTA mRNA表达发生了明显的变化。提示P物质可能不仅参与早期正畸牙周组织的炎症损伤过程，而且可能参与了后期的组织修复重建过程。

［关键词］  P物质  前速激肽原A（PPTA）  牙齿移动  三叉神经节  反转录-聚合酶链反应

　　Changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during and after Tooth Movement.

　　SUN Ying-ming, LUO Song-shu, ZHAO Yu-hui.

　　Department of Orthodontics,Stomatological Colloge,The Fourth Military Medical University,Xi’an 710032　　　　［Abstract］Objectives: To investigate  the relationship between substance P and  orthodontic tooth movement. Methods: The first  maxillary molar was moved mesially by an orthodontic force for 2 hours,8 hours,1 days,3 days,1 week and 2 weeks,whereas the other groups were observed after removal of appliances for 1 week,2 weeks and 4 weeks.The expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion were detected with reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR). Results: The expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion was stonger than that in control group at all the time points; PPTA mRNA level was increased after 2 hours and reached the peak level around 8 hours-3 days during tooth movement,4 weeks after tooth movement PPTA mRNA level was still higher than that in the controls. Conclusions: The results suggested the involvement of substance P in both early stages of periodontal remodeling and later in the regenerative processes of the periodontal ligament during and after orthodontic tooth movement.

　　［Key words］  Substance P  PPTA  Tooth movement  Trigeminal ganglion  RT-PCR

    P物质（Substance P，SP）是最早发现的神经肽，牙周组织内的SP主要是由三叉神经节初级感觉神经元合成。研究发现正畸牙齿移动过程中牙周组织SP阳性神经纤维的数量和染色强度发生了明显的变化，并具有一定的规律性。但目前还不明确二者之间究竟有何具体的联系。PPTA（前速激肽原A）是编码P物质的前体。我们采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法观察正畸牙齿移动不同时期大鼠三叉神经节内PPTA mRNA的变化情况，从中枢合成方角度和mRNA水平来探讨SP与正畸牙齿移动的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验分组、动物模型制备和取材  SD雄性大鼠，体重（180±20） g（7~9周）。加力装置采用结扎丝将一根镍钛螺旋拉簧一端扎在上颌第一磨牙上，另一端结扎在上颌中切牙上，并用自凝塑料加固结扎丝与牙连接处。加力力值为50克，使磨牙向近中移动。大鼠随机分为对照组（安置装置不加力）和牙齿移动组。两组根据不同时间分为以下几个亚组：加力2 h组、加力8 h组、加力1 d组、加力3 d组、加力1周组、加力2周组、撤力1周组、撤力2周组、撤力4周组。每组6只大鼠。待动物达规定时间点后，将动物乙醚吸入麻醉后迅速断头取三叉神经节，放入液氮中速冻。

　　1.2  组织总RNA的提取  采用异硫氢酸胍一步法提取大鼠三叉神经节总RNA。RNA纯度260/280比值>1.9。

　　1.3  cDNA合成和PCR扩增  每只大鼠取2.5 μg总RNA在总体积25 μL中进行cDNA合成，其中5×反转录缓冲液5 μL，10 mmol/L dNTPs 3 μL，25 nmol/L Oligo-dt,AMV 2 μL,RNA酶抑制剂0.5 μL。PCR反应体系为10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 2 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，cDNA模板1 μL，灭菌双蒸水加至50 μL。以β-肌动蛋白（β-actin）作为本实验的内参照物，设计的引物序列如下。引物序列：PPTA：上游引物5′-TTCCACTCAACTGTTTGCAG-3′；下游引物 5′-GTAGT TGTGC ATTGC TCTTC-3′；β-actin：上游引物5′-GAGAC CTTCA ACACC CCAGCC-3′；下游引物 5′-TCGGG GCATC GGAAC CGCTCA-3′。扩增条件为94 ℃ 3 min，58 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min，共30个循环，72 ℃延伸8 min。扩增长度分别为283 bp和422 bp。

　　1.4  PCR产物分析及统计学处理  PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，用UVP凝胶成像系统进行观察，用Labworks软件对阳性条带的密度进行分析，以PPTA与β-actin的条带密度比值作为评定PPTA mRNA的相对表达量。将实验组与对照组的条带密度比值做差异性的统计分析（SPSS10.0）。

　　表1  大鼠正畸牙齿移动不同时间点三叉神经节PPTAmRNA 水平的改变　略

　　2  结果

    不同时间点各对照组之间未发现显著性差异（结果在此省略）；正畸牙齿移动过程中大鼠三叉神经节PPTA mRNA的表达发生了明显的变化，并具有一定的规律性。加力2 h大鼠三叉神经节PPTA mRNA的表达量开始增加，加力8 h至加力3 d达到最高，至撤力后2~4周PPTA mRNA的表达量开始下降，但 PPTA mRNA水平仍然明显高于对照组（P<0.05），见图1、表1。

图1  不同时间点PPTAmRNA的特异性扩增条带　略

　　3  讨论

    P物质作为神经递质的神经肽，它主要是在背根神经节和三叉神经节内初级感觉神经元内合成，以囊泡的形式通过轴突向外周和中枢端运输，一旦神经受到刺激即可从末梢分泌。PPTA作为编码P物质的前体物质在三叉神经节内其 mRNA主要存在于三叉神经节的中、小神经元中，并且只有少量神经元表达PPTA mRNA［1］。牙周组织P物质样神经纤维来源于三叉神经节，主要分布在牙龈、牙周间隙的中份和根间区沿血管分布。切断下牙槽神经，牙周组织中的P物质样神经纤维完全消失；去除交感颈上神经节，不影响牙周组织中的P物质样神经纤维分布。在正常的牙周组织中牙龈P物质样神经纤维较为丰富，而牙周膜组织中比较稀少［2］。

    在正畸牙齿移动过程中，研究发现牙周P物质神经纤维发生了明显的反应。Davidovitch等［3］观察了在猫上颌尖牙向远中倾斜移动过程中的P物质反应，发现加力后1 h P物质免疫反应就开始增强，尤其在张力区，这种染色增加的现象一直持续到12 h，但到24 h，其染色密度下降到对照组水平，且一直持续到14 d。Norevall等［4］观察了大鼠上颌第一磨牙向颊侧移动过程中的P物质反应，该实验不仅观察了加力阶段而且还包括撤力后牙周组织修复阶段。发现加力后24 h或3 d，P物质免疫反应明显增强；撤力后14 d P物质免疫反应仍然很强；撤力后28 d P物质免疫染色强度开始下降，但仍明显高于对照组。

    本研究采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法观察正畸牙齿移动不同时期大鼠三叉神经节内PPTA mRNA的变化情况，从SP中枢合成和mRNA水平来探讨它与正畸牙齿移动的关系。我们发现大鼠正畸牙齿移动过程中三叉神经节PPTA mRNA的表达发生了明显的变化，并具有一定的规律性。加力2 h PPTA mRNA的表达量开始增加，加力8 h至加力3 d达到高峰，撤力后阶段PPTA mRNA水平仍然明显高于对照组。该结果与Norevall的外周P物质神经变化的发现颇为相似。但比较以往的研究结果来看，不同的实验对象、加力方式及观测手段都可能影响到实验结果。

    综合正畸加力和撤力后P物质外周分泌水平的变化以及中枢合成水平的变化来看，P物质可能不仅参与早期正畸牙周组织的炎症损伤过程，而且可能参与了后期的组织修复重建过程。有学者已经在这方面作了初步的探讨，研究发现切断下齿槽神经，能明显抑制正畸牙齿张力侧新骨的形成［5］。另有研究发现不仅在大鼠牙周组织血管有SP受体的存在，而且在牙周成纤维细胞、成牙骨质细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞内都有SP受体的表达［6,7］；体外研究也证实了SP对这些细胞的直接作用［8］。但P物质在正畸组织改建中确切的神经调控机制还有待进一步深入地研究。

　　参考文献

　　［1］  Amara SG,Arizza JL,Leff SE. Expression in brain of a messenger RNA encoding a novel neuropeptide homologous to calcitonin gene-related peptide ［J］. Science,1985,229∶1 094-1 097

　　［2］  Wakisaka S, Nishikawa H, Ichikawa, et al. The distribuion and origin of substace P-like immunoreactivity in the rat molar pulp and periodontal tissues ［J］,1985,30∶813-818

　　［3］  Davidovitch Z,Nicolay OF,Ngan PW, et al.Neurotransmitters,cytokins and the control of alveolar bone remodeling in orthodontics ［J］. Dent clin N Am,1988,32(3)∶411-435

　　［4］  Norevall LI,Forsgren S,Matsson L.Expression of neuropeptides during and after orthodontic tooth movement in the rat ［J］. J Eur Ortho,1995,17(4)∶331-325

　　［5］  Yin Zhong D.Effect of inferior alveolar nerve axotomy on bone formation during orthodontic tooth movement in rabbit ［J］. J Osaka Dent Sch,1993,33(1)∶45-49

　　［6］  Fristad I,Vandevska-Radunovic V,Hals I ,et al. NK-1 receptor expression in the mature dental pulp of rats ［J］. Arch Oral Bio, 1999(44)∶191-195

　　［7］  Goto T,Yamaza T,Kido MA,et al.Light and electron-microscopic study of the distribution of axons containing substance P and the localization of neurokinin-1 receptor in bone ［J］. J Tissue Res ,1998, 293(1)∶87-93

　　［8］  Mori T, Ogata T,Okumura H,et al.Substance P regulates the function of rabbit cultured osteoclast:increase of intracellular free calcim concentration and enhancement of bone resortion ［J］. Biochem Biophys Res Commun,1999,262∶418-422