胶原膜与牙周膜成纤维细胞复合物引导成骨作用实验研究

作者：骆凯，闫福华，金岩，刘源，何大为【关键词】  成纤维细胞;引导组织再生;胶原;骨再生;生物医学工程

　　摘要: 目的  探讨牙周膜成纤维细胞与引导组织再生胶原膜（BME-10X）复合物在大鼠颅骨皮质骨表面引导成骨的能力，为其应用于牙周组织工程研究提供实验依据。  方法  体外培养SD大鼠牙周膜成纤维细胞并以5×10 6 mL -1 的细胞浓度与BME-10X复合培养10d后，植入同种异体SD大鼠颅骨皮质骨表面（复合细胞组）;以单纯BME-10X组及骨膜刮除组为对照，于植入后3，6周进行组织学观察。  结果  单纯BME-10X组及骨膜刮除组未见类骨质形成，复合细胞组在材料表面与颅骨交界处可见明显的骨样组织形成，随着植入时间的延长，成骨作用明显。  结论  牙周膜成纤维细胞与BME-10X复合物在大鼠颅骨皮质骨表面具有明显的引导成骨能力。          　　牙周结缔组织中I型胶原最多，因此商品化的引导组织再生胶原膜多以I型胶原作为其主要成分。该材料具有无抗原性、生物相容性好、能促进细胞增殖、加快伤口愈合、降解产物无毒副作用等优点，已广泛应用于临床 ［1］ 。随着组织工程学的兴起，它又作为牙周组织工程的支架材料而倍受关注。本实验在以往实验基础上 ［2-4］ ，采用商品化的引导组织再生胶原膜BME-10X为支架材料，以SD大鼠牙周膜成纤维细胞（PDLF）为种子细胞，初步探讨SD大鼠PDLF与BME-10X复合物同种异体颅骨皮质骨表面引导成骨作用，为其应用于牙周组织工程研究提供实验依据。     　　1 材料和方法     　　1.1 主要试剂和仪器 DMEM培养液、I型胶原酶、胰蛋白酶（Gibco，美国），新生牛血清（杭州四季青生物制品有限公司），国产胶原膜BME10-X（中国医学科学院生物医学工程研究所），超净工作台（NUAIR，日本），CO 2 孵箱（NUAIR，日本），SD大鼠（第四军医大学实验动物中心）。    　　1.2 SD大鼠PDLF的体外培养及扩增 参照文献［5］的方法，将12周健康雄性SD大鼠的下颌骨取下，体外将磨牙区的牙龈及其他软组织刮除干净后小心拔出第一磨牙，随即在无菌条件下用含抗生素的PBS液冲洗，以除去血液。1%I型胶原酶消化1h，将牙取出，离心，弃上清;加入DMEM培养液（内含10%小牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL）制成细胞悬液，在体积分数为0.05的CO 2 孵箱中培养，待细胞贴壁后隔日换液。取生长状态良好的第4代细胞用于实验。    　　1.3 材料制备 国产胶原膜BME-10X主要成分为牛I型胶原。该膜半透明，表面不光滑，呈绒毛状，具有多孔网状结构，孔径大小不一。实验时将材料制备成4mm×4mm，环氧乙烷消毒过夜，紫外灯照射30min，置24孔板内DMEM预湿2h后接种细胞。    　　1.4 SD大鼠PDLF与BME-10X复合培养 0.25%胰酶及0.1%EDTA将状态良好的4代细胞消化下来，调整细胞浓度至5×10 6 mL -1 ，接种于材料上，每块接种20μL，置于37℃孵箱中，2h后加培养液2mL，以后每3d换一次培养液。体外复合培养10d后植人SD大鼠颅骨皮质骨表面。    　　1.5 SD大鼠颅骨皮质骨表面埋植 选用雄性SD大鼠（12周龄，体质量280～300g）18只。实验随机分为BME-10X组、骨膜刮除组和SD大鼠PDLF与BME-10X复合组，每组6只。将动物用35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，常规消毒铺巾，在颅骨前缘弧形切开皮肤、皮下和骨膜，向后翻起皮肤及软组织，将骨膜刮除。生理盐水冲洗后，SD大鼠PDLF与BME-10X复合组将PDLF与BME-10X复合物植入实验动物颅骨皮质骨表面，缝合皮肤;对照组包括BME-10X组及骨膜刮除组，BME-10X组植入不复合细胞的材料，而骨膜刮除组则在刮除骨膜后直接缝合皮肤。

       1.6 组织学观察 分别于第3周和6周从各组SD大鼠中随机处死3只。取出颅骨及材料复合物，4%多聚甲醛固定，脱钙后常规石蜡包埋制备7μm厚的切片，常规苏木精-伊红染色，二甲苯透明，封固。     　　2 结 果     　　实验动物均成活，无感染及其它并发症发生。植入6周后大体标本观察发现，胶原膜未完全降解仍存在于大鼠颅骨表面，周界清晰（图1）。组织学检查发现植入后3周，PDLF与BME-10X复合组在材料与颅骨间可见明显的类骨质形成，皮质骨表面成骨细胞增殖活跃，未见明显的淋巴细胞及巨噬细胞等免疫细胞浸润（图2）;植入后6周，随着材料的逐渐降解，类骨质不断形成，取代逐渐降解的材料，可观察到新生的骨组织及血管，成骨方式近似膜内成骨（图3）;单纯BME-10X植入组，埋植入颅骨表面后3周及6周均未见类骨质于颅骨表面形成，随着植入时间的延长，材料逐渐降解为肉芽组织所替代（图4，5）。骨膜刮除组术后3周组织学检查发现仅在颅骨表面形成条索状的肉芽组织，6周时组织学表现同3周组（图6）。 　　图1  － 图6  略     　　3 讨 论     　　牙周病是危害人类口腔健康的两大疾病之一，可破坏牙周支持组织，使牙周附着丧失，最终导致牙齿松动脱落。牙周治疗的最终目的是实现牙周组织再生并形成新附着，但现有的治疗方法，包括引导组织再生治疗术（GTR）和自体、异体骨移植术，很难使水平型牙槽骨缺损得到有效修复。应用组织工程技术治疗牙周骨缺损，其组成细胞处于激活状态，较传统治疗方法具有更强组织重建和再生的潜力，为治疗牙周病提供了新的途径 ［6］ 。    　　组织工程研究的主要内容包括种子细胞的选择和培养、支架材料生物相容性检测、种子细胞与支架材料复合物联合培养及体内植入三个方面。研究显示，PDLF是牙周膜细胞中主要的细胞群，能向成纤维细胞、成牙骨质细胞、成骨细胞分化，并具有成骨细胞表型特征 ［7-8］ ，在牙周病治疗新附着形成中发挥重要的作用，是牙周组织工程理想的种子细胞。同种子细胞的选择一样，适宜的支架材料对组织工程研究同样重要。支架材料不仅为细胞提供获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，同时也是形成新的具有一定形态和功能的组织、器官的物质基础。作为GTR屏障膜之一的胶原膜具有很多优点 ［1］ ，如参与牙周组织的代谢、对牙周膜成纤维细胞有引导性、能抑制冠方上皮细胞移动等特性，已广泛应用于临床。Takata等研究发现，Waster大鼠PDLF在牛I型胶原制成的GTR膜上增殖情况较佳 ［9］ 。本课题组以往的研究也发现GTR胶原膜有利于骨髓基质细胞及PDLF的增殖 ［2-4］ ，体外复合PDLF培养可构建组织工程牙周膜 ［3］ 。为此，本研究选用国产GTR胶原膜BME-10X为支架复合培养SD大鼠PDLF探讨其引导成骨作用。颅骨与颌面部骨类似，在胚胎学上均通过膜内成骨的方式成骨;在解剖学上，颅骨为两层皮质骨内间隔松质骨，与下颌骨类似;在生理上，颅骨的皮质骨类似于萎缩的下颌骨。因此颅骨是检测颌面部植骨材料的常用部位 ［10］ 。陈晓兵等利用兔颅骨作动物模型，于颅骨皮质骨表面放置β-TCP，观察β-TCP的引导成骨能力及降解率，为β-TCP应用于牙槽嵴增高术提供实验依据 ［11-12］ 。本研究发现，与对照组相比BME-10X细胞复合物具有良好的引导骨再生作用，植入SD大鼠皮质骨表面可有大量的类骨质出现及骨样组织形成，新生骨小梁与原有皮质骨之间的纤维结缔组织在形态学上与牙周膜相类似;对照组即GTR胶原膜埋植组未见类骨质形成的原因可能是由于实验中未造成骨缺损，仅仅在骨面上覆盖胶原膜，而GTR胶原膜引导成骨作用的原理是保护骨缺损区血凝块最终成骨，所以未观察到类骨质形成。该实验结果为BME-10X细胞复合物应用于修复牙周病所致牙槽骨缺损提供了一定的实验依据，但PLDF与BME-10X复合物能否最终实现牙周组织再生还有待进一步的实验研究。此外，本实验虽然未观察到明显的免疫排斥反应，这可能是由于分离培养的PDLF为较单一的细胞系，不同于器官、组织移植，不含有免疫组织，如微血管、淋巴组织等，其本身的抗原性很低，但如要确切了解免疫情况，应进行混合淋巴细胞培养实验，这将在今后的实验中予以完善。 　参考文献:     　　［1］ Bunyaratavej P，Wang HL.Collagen membranes:a review［J］.JPeriodontol，2001，72（2）:215-229.     　　［2］ 闫福华，刘崇武，周广东，等.骨髓基质细胞在三种可吸收生物膜上附着及增殖的比较研究［J］. 福建医科大学学报， 2002，36（1）:10-12.    　　［3］ 骆 凯，闫福华，金 岩，等.组织工程方法构建复合培养细胞的引导组织再生膜［J］. 牙体牙髓牙周病学杂志， 2003，13（3）:139-141.    　　［4］ 闫福华，骆 凯，金 岩，等.牙周膜成纤维细胞与三种可吸收引导组织再生膜生物相容性实验研究［J］. 口腔医学研究， 2003，19（3）:161-165.    　　［5］ Gao J，Symons AL，Haase H，et al.Should cementoblasts express　alkaline phosphatase activity?Preliminany study of rat cememto-blasts in vitro［J］.J Periodontol，1999，70（9）:951-959.    　　［6］ Bartold PM，McCulloch CA，Narayanan AS，et al.Tissue engi-neering:a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology［J］.Periodontology，2000，24:253-269.    　　［7］ Nojima N，Kobayashi M，Shionome M，et al.Fibroblastic cells de-rived from bovine periodontal ligaments have the phenoltypes of　osteoblasts［J］.J Periodont Res，1990，25:179-185.    　　［8］ Isidor F，Karring T，Nyman S，et al.The significance of coronal　growth of periodontal ligament tissue and new tissue for new at-tachment formation［J］.J Clin Periodontol，1986，13:145-150.

　　［9］ Takata T，Wang HL，Miyauchi M.Attachment，proliferation and　differentiation of periodontal ligament cells on various guided tis-sue regeneration membranes［J］.J Periodont Res，2001，36（5）:322-327.    　　［10］ Schmitz JP，Hollinger JO.The critical size defect as an experi-mental model for craniomandibulofacial nonunions［J］.Clin Orthop Relat Res，1986，205（4）:299-308.    　　［11］陈晓兵，薛振恂，周树夏.多孔块状β-磷酸三钙陶瓷兔颅骨皮质骨表面埋植引导成骨定量研究［J］. 实用口腔医学杂志， 1998，14（4）:256-257.    　　［12］陈晓兵，薛振恂，周树夏.多孔块状β-磷酸三钙陶瓷兔颅骨皮质骨表面埋植可吸收性的定量研究［J］. 口腔医学研究， 2002，18（4）:234-235.     　　A Study of Bone Formation Induced by Guided Tissue Regeneration　Collagen Membrane and Cultured Cell Complex      　　LUO Kai 1 ，YAN Fu-hua 1，2 ，JIN Yan 3 ，LIUYuan 3 ，HE Da-wei 3     　　1.The School of Stomatology，Wuhan University，Wuhan430079，China    　　2.The Affiliated Stomatology Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou350002，China

　　3.Department of Oral Histology and Pathology，School of Stomatology，Fourth Military Medical University，Xi'an710032，China       　　ABSTRACT: Objective To study the osteoinductivity of guided tissue regeneration collagen membrane（BME-10X）and periodontal ligament fibroblasts（PDLF）complex on bone surface. Methods Sprague-Dawley rat PDLF were cultured and seeded at a density of5×10 6 mL -1 onto the BME-10X for10days in vit-ro，and then implanted subperiostealy on cortical bone surface of calvarium in SD rats. Histological examina-tion was performed at3and6weeks after the PDLF and BME-10X complex was implanted. Results New bone was formed in BME-10X implanted group than in controls. Conclusion PDLF and（BME-10X）complex has the capability of osteoinductivity on the surface of cortical bone.

KEY WORDS: fibroblasts;guided tissue regeneration;collagen;bone regeneration;biomedical engineering 

　　作者单位: 1.武汉大学口腔医学院，武汉 430079　2.福建医科大学附属口腔医学院，福州 3500023.第四军医大学口腔医学院，西安 710032     　　作者简介: 骆 凯（1976～），男，医师，武汉大学2003级博士研究生 通讯作者: 闫福华