米非司酮逆转卵巢上皮性癌耐药细胞多药耐药的作用机制

紫杉醇是治疗卵巢上皮性癌(卵巢癌)的一线药物,肿瘤细胞对其产生多药耐药(MDR)是化疗失败的重要原因之一[l-2]。MDR指肿瘤细胞对结构和作用机制各不相同的药物均产生耐药的现象。目前认为,导致肿瘤细胞对紫杉醇产生MDR的机制主要有:(1)P-糖蛋白(P-gp)表达增强:P-gp属于三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ATP-bindingcassette,ABC) 转运蛋白,作为能量依赖的药物输出泵,能将药物由细胞内泵出,导致细胞内保持较低的药物浓度,从而产生耐药性; (2)体内解毒酶系统:该系统可促进体内有毒物质的排出, 防止有毒化合物与DNA、RNA和蛋白质等生物大分子物质的结合,其中研究较多的是谷胱甘肽S转移酶(GST),GST水平升高与紫杉醇MDR有关;(3)细胞凋亡途径:蛋白激酶 C-α (PKC-α)、抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病2蛋白 (bcl-2)和促进凋亡因子bcl-2 相关X蛋白质(bax)也参与了紫杉醇引起的MDR;(4)月中瘤微环境的改变。研究发现,米非司酮可作为1种新的化疗增敏剂,抑制卵巢癌细胞及顺铂耐药的卵巢癌细胞的增殖,抑制卵巢癌在顺铂化疗问歇期的复发,逆转胃癌细胞的多药耐药性等[3-6]。对紫杉醇耐药的卵巢癌患者采用口服米非司酮和紫杉醇的治疗有一定疗效[7],但其具体作用机制尚不清楚。本研究探讨米非司酮逆转卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/T多药耐药性的机制,以期为临床应用米非司酮治疗难治性卵巢癌提供实验依据。

—、材料弓方法

 1.主要材料:人卵巢癌细胞A2780购于中国典型培养物保藏中心;人卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/T购于南京凯皋生物科技发展公司,该细胞对紫杉醇、环孢素A耐药;均置于含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养基中在37℃ 、 5%CO2培养箱巾培养。米非司酮原粉由北京紫竹药业有限公司提供,用无水乙醇溶解,配成10mg/ml浓度,置-20 ℃ 保存;实验时用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度,使乙醇终浓度<1%。若丹明123试剂购自南京凯基生物科技发展公司,逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒购自日本TdKaRa公司, 藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗人MDRl抗体购自美国eBosocnce公司,兔抗人PKC-α 抗体、GST抗体、bt1-2抗体、bax抗体购自美国CellSignaling公司。

2.方法:(1)流式细胞仪检测米非司酮对A278O/T和A2780细胞P-gp外排功能的影响:用0.25%胰蛋白酶消化、收集处于对数生长期的A278O/T和A278O细胞,调整细胞密度,以每孔1ml接种于24孔培养板,置37℃、5%C02培养箱中培养。次日细胞贴壁后弃去培养液;每孔重新加人含不同浓度米非司酮的RPM1-1640培养基2ml,使米非司酮终浓度分别为1.25、2.5、5ug/ml,每一浓度设6个复孔,同时设无药对照细胞6孔。分别于培养24、48、72 h后,加人若丹明123试剂(细胞内的若丹明123可作为P-gp的底物被泵到细胞外),浓度调为10ug/ml。置 37℃ 、5%CO2培养箱继续培养1h,收集细胞、离心,500 ul磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞c用流式细胞仪检测荧光值即细胞内若丹明123的累积率(表示P-gp即外排功能),每管计数10000个细胞。 (2)流式细胞仪检测米菲司酮对A278O/T细胞P-gp表达率的影响:A278O/T细胞培养、米非司酮作用同(1),同时设无药的对照A278O/T细胞和A278O 细胞各6孔,培养72 h后, 收集细胞,4℃ 冷PBS冲洗1次。加入含5ul PE标记的 MDR1抗体(P-gp是MDRl蛋白最主要的成分蛋白)的PBS 1OOul,4℃ 避光孵育1h,离心弃去上清液。用流式细胞仪检测荧光值即细胞膜上P-gp蛋白的表达率,每管计数10000个细胞。(3)RT PCR技术检测米非司酮对A2780/T 细胞P-GPmRNA表达的影响:A2780/T细胞培养、米非司酮作用同(1),同时设无药的对照A278O/T细胞和A278O细胞各6孔,培养72h后,收集细胞,TRIzol试剂提取总RNA。引物设计:参照引物设计基本原则,用Oligo6.0软件完成,上游:5′-ATGTAAGGTTTCTACGGGA-3,下游:5′ ATCCACGGACTACTCCTACG- 3′ ,扩增基因5′末端550bp的片段,并设磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因(150bp)为内参照。逆转录条件:16℃ 30min,55℃ 1h,85℃ 10min。PCR反应45个循环以扩增DNA,条件为:变性94℃ 50s,退火56℃ 50s;延仲72℃ 50s。扩增产物用溴化乙锭(EB)染色, 1.5%琼脂糖凝胶电泳。以P-gp峰值/GAPDH峰值比值表示R-gpmRNA的表达水平。(4)蛋白印迹法(westernblot) 检测米非司酮对A278O/T细胞PKC-α 、GST、bcl-2、bax蛋白表达的影响:实验准各步骤同(3),培养72h后,收集细胞, 加人westernblot细胞裂解液100ul/孔,4℃ 静置30min后, 离心,取上清液。然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并将蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上室温封闭2h;一抗(PKC-α、GST、bcl-2、bax抗体)孵育过夜,洗膜,二抗孵育1h,洗膜。用GE ImageQuantLAS4000mini仪器读片,以GAPDH为内参照,并根据条带亮度对比判定是否有抑制作用。

3统计学方法:利用GraphPadPrism5软件对数据进行统计学分析和制图。数据用x±s表示。独立的两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。

二、结果

 1.米非司酮对A278O/T和A278O 细胞P-gp外排功能的影响:对A278O/T细胞,当米非司酮作用时问延长或作用剂量增大时,相比无药对照的A夕⑽/T细胞内的若丹明123 累积率逐渐增高(P<0.05),呈明显的时间和剂量依赖关系;P-gp外排功能受米非司酮抑制,在米非司酮作用72h 时,其抑制作用最明显(P<0.05)。对于A278O细胞,与无药的对照细胞相比细胞内若丹明123的累积率并不受米非司酮作用的影响(P>0.05),作用时间延长或作用剂量增大均不影响若丹明123的累积率。见表1。

2米非司酮对A278O/T细胞P-gp蛋白、mRNA表达的影响:与亲本细胞A278O[(7.05 ±0.84)%]相比, A278O/T细胞的P-gp表达率[(99.95±2.45)%]显著升高(P<0.05)。米非司酮作用后,与未进行米非司酮作用的A278O/T 细胞相比,A2780/T细胞的P-gp表达率[米非司酮浓度 1.25、2.5、5 ug/m1时分别为(77.48± 2.45)%、(66.56± 1.98)%、(47.24 ±3.02)%]明显下降,并呈剂量依赖关系; 15ug/ml米非司酮作用,即可使A278O/T细胞的R田表达率降低;5ug/ml米非司酮可使A278O细胞P-gp表达率降至很低,但仍未能达到敏感细胞(即A278O细胞)的水平。

敏感细胞A2780和耐药细胞A2780/T P-gp mRNA表达水平分别为0.06 ±0.03 、43.78± 0.71,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在耐药细胞A278O/T中,与不加药的A278O/T相比,1.25 ug/ml米非司酮作用后,P-gp mRNA表达水平(26.59 ±1.56)降低;2.5ug/ml米非司酮作用后,p-gp mRNA表达水平(13.92 ±1.86)也降低;经5ug/ml米非司酮作用,⒎P-gpmRNA表达水平(6.OO± 0.74)明显降低; 米非司酮对A278O /T RP-gp mRNA表达的抑制作用呈剂量依赖性(P<0.05),与流式细胞仪检测结果一致。

3米非司酮对A2780/T细胞GST、PKC-a、bc1-2、bax蛋白表达的影响: A278O/T细胞中GST的表达高于A278O细胞;米非司酮作用可减低A278O/T细胞中G田的表达,并且随着米非司酮作用浓度增高,GST的表达逐渐下降。相比于 A2780细胞,A278O /T细胞中PKCα的表达无明显差异; A278O细胞随着米非司酮作用浓度增高,PKCα的表达逐渐下降,5ug/ml米非司酮的抑制作用最明显。在耐药细胞 A278O/T中有bax蛋白的表达,但未检测到lDc⒓ 蛋白的表达;而亲本细胞A278O中有少量bcl-2和bax蛋白的表达;米非司酮对A278O/T细胞中bax蛋白的表达无影响。见图1。

三、讨论

米非司酮是孕激素拮抗剂,广泛用于终止妊娠、引产扩张宫颈和紧急避孕等[8-9]。有研究报道,米非司酮有抗肿瘤和逆转肿瘤MDR的作用,并且无明显的不良反应[6-7,10]。这也引起了对米非司酮逆转肿瘤MDR研究的关注。近年来, 对卵巢癌耐药的研究显示,米非司酮作为化疗增敏剂,可抑制卵巢癌细胞的增殖、卵巢癌顺铂耐药细胞的增殖,可抑制卵巢癌在顺铂化疗间歇期的复发[3-4,6]。这些都是以卵巢癌顺铂耐药细胞为研究对象,而紫杉醇目前广泛用于卵巢癌化疗,为早期治疗复发性及难治性卵巢癌的首选用药。但卵巢癌对紫杉醇耐药是限制其应用、影响疗效的重要因素。因此,通过各种途径研究耐药机制,寻求耐药逆转方法,最大限度逆转耐药有望提高卵巢癌患者的生存时间⊙故本研究以卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/T为研究对象,探讨米非司酮逆转其MDR的机制。

研究发现,卵巢癌对紫杉醇产生的MDR与R押表达升高密切相关[11] 。R-gp属ABC转运蛋白,作为一种能量依赖的药物输出泵,能将药物由细胞内泵出,导致细胞内保持较低的药物浓度,从而产生耐药性。本课题组对30例采用米非司酮药物流产的绒毛组织进行P-GP染色,发现米非司酮可抑制R叩的表达「I21。为了进一步探讨米非司酮的化疗增敏作用,本研究分析米非司酮作用前后A2780/T细胞及亲本A278O 细胞内若丹明123的累积情况、P-gp表达情况, 结果提示,米非司酮对P-gp药物外排功能的抑制作用呈剂量和时间依赖关系;米非司酮作用” h时,其抑制作用最明显。从P-gp的蛋白和基因水平表达比较,A278O/T细胞的 P-gp表达较A2780细胞显著升高;1.25ug/ml米非司酮作用,即可使A2780 /T细胞的P-gp表达率降低,并呈剂量依赖关系。说明米非司酮不仅可抑制P-GP的外排功能,而且抑制P-gp蛋白和基因的表达,是逆转耐药的重要途径之一。

 PKC是一种普遍存在的磷脂依赖性酶,与细胞增殖、分化、凋亡的信号传导相关,也参与了MDR形成过程的调控。 Mizutani等[13] 的研究认为, P-gp是由PKC磷酸化的,磷酸化后的P-GP活化而具有跨膜转运功能,当上调PKC时可增加 P-gp的磷酸化,使其跨膜转运功能增强,减少细胞内的药物聚集,产生耐药性。下调PKC可减少P-GP的磷酸化,可以增加细胞内药物的聚集,部分逆转耐药性。并且这种磷酸化过程胄邕够被PKC抑制挤抑制,而初乏PKC激活剂增强。在PKC 众多的同功酶中以α同功酶(即PKC-α )与MDR的关系最为密切。本研究发现,在P-gp过度表达的卵巢癌耐药细胞 A2780/T中,PKC-α 蛋白的表达与亲本细胞A2780 并无明显差异,A2780/T细胞随着米非司酮作用浓度增高,PKC-α的表达逐渐下降,呈剂量依赖性。所以,米非司酮通过抑制PKC-a的表达,从而影响下游蛋白P-gp的活性。

虽然与P-gp有关的MDR被称为经典的MDR,但肿瘤 MDR现象的产生机制多样。体内谷胱甘肽(GSH)依赖性解毒酶系统活性升高也是产生MDR的主要原因之一.正常情况下,该解毒酶系统可作为1种保护机制使细胞免受损伤, 而肿瘤细胞可通过调节GSH水平、增加GSH活性等加速药物的代谢,从而降低药物敏感性。其中研究较多的是GsT, GST是体内GSH依赖性解毒酶系统的1个主要蛋白,其活性升高是产生MDR的重要原因c Tew[14] 的体外实验表明, 紫杉醇的耐药与GST水平升高有关。本研究发现,耐药细胞A2780 /T中GST蛋白的表达明显高于亲本细胞A2780,与上述结论相符。而且,本研究发现,1.25ug/ml米非司酮即可抑制GST在蛋白水平的表达,并呈剂量依赖性。这也提示,米非司酮的耐药逆转作用可能与降低GST表达,使体内GSH依赖性解毒酶系统活性降低有关。

紫杉醇以细胞内微管为作用靶点,抑制微管解聚,与微管结合后将细胞阻滞于G2/M期,并改变各凋亡途径蛋白的表达,促使细胞凋亡。如果细胞的凋亡途径受到抑制,会导致耐药的丿丨|现。bcl-2和bax都是凋亡过程中的重要分子, 都是凋亡相关蛋白,两者形成的二聚体可以抑制细胞凋亡。虽然有研究提出,bcl-2的高表达能抑制化疗药物介导的细胞凋亡而产生耐药[I5],但是本研究发现,在紫杉醇耐药细胞 A278VT中并未检测到bcl-2 蛋白的表达,亲本细胞A278O 中有少量的bcl-2表达。Ferlini等[16]建立了耐紫杉醇的 A278O 细胞系、耐紫杉醇和环孢素A的A278OTC细胞系,发现随着紫杉醇剂量的增加,两种细胞系的bcl-2 表达均下调; 当A2780TC细胞转染bcl-2 后,其对紫杉醇的敏感性有部分恢复。这表明,在卵巢癌紫杉醇耐药中bc⒚ 的低表达起了一定作用,本研究结果与此相符⊙相应的, Ferlini等[16] 通过免疫组化方法分析了临床上卵巢癌组织的bcl-2,表达情况, 发现在对紫杉醇耐药的卵巢癌患者中呈现bcl-2 低表达。基础与临床研究结果提示,bcl-2表达的下调可能与紫杉醇耐药有关;在临床化疗中,bcl-2低表达者可能更容易对含有紫杉醇的化疗方案产生耐药。本研究还检测了bax的表达情况,在耐药细胞A2780/T中有bax表达,亲本细胞A278O 中 bax低表达。虽然Schuyer等[15]的研究提出,bcl-2过表达和 bax表达下调与紫杉醇耐药有关,但是本研究的结果提示, 在卵巢癌紫杉醇耐药细胞A278O/T中bcl-2 不表达而bax高表达,bcl-2/bax的比例下降。bcl-2/bax比例下降时也可能抑制细胞凋亡并改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性而影响临床过程,但是bcl-2/bax比例下降的程度及诱导耐药的机制有待进一步研究。

综上所述,米非司酮能有效逆转卵巢癌紫杉醇耐药细胞 A2780/T的多药耐药性,这一作用可能与米非司酮抑制P-gp 的外排功能、P-gp表达以及PKC-α、GST的表达有关bcl-2 表达的下调、bcl-2/bax蛋白表达比例下降可能作为卵巢癌紫杉醇耐药的判断指标。

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