组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin对子宫内膜癌细胞凋亡及HDAC4和p21表达的影响

子宫内膜癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之—,占女性生殖道恶性肿瘤的20%~30%,近年来在世界范围内发病率呈上升趋势[1]。表观遗传学改变是恶性肿瘤发生的主要机制之一,组蛋白去乙酰化是表观遗传学改变的一种[2]。研究发现,通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonc Deacetylase inhibitor,HDACi)作用于子宫内膜癌细胞,可以上调抑癌基因p21的表达而使肿瘤细胞的活性受到抑制[3],还能引起细胞周期的阻断和肿瘤细胞选择性凋亡,具有潜在的抗肿瘤作用[4]。本研究通过HDACi——apicidin作用于不同类型的子宫内膜癌细胞,探讨apicidin对子宫内膜癌发生、发展的作用机制。

一、材料与方法

 1.主要材料:人正常子宫内膜上皮细胞(human endometrial epithelialce11,HEEC)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),高分化子宫内膜腺癌细胞株HEC-1B、低分化子宫内膜腺癌细胞株KLE购白北京协和细胞资源中心。 DMEM/F12培养基、MEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司,DMEM高糖培养基购自武汉博士德生物工程有限公司,apicidin(批号:061M4064V )购自美国Sigma公司,膜联蛋白V(annexin V )异硫氰酸荧光素 (FTTC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(批号: KGA107)购自南京凯基生物科技发展有限公司,一抗兔抗人组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetyase 4,HDAC4)、p21搞体购自美国CST公司,二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及β肌动蛋白(β-actin)均购自武汉博士德生物工程有限公司。

 2.方法:(1)细胞培养:HEEC培养于DMEM高糖培养基中,HEC-1B细胞培养于MEM培养基(加入丙酮酸钠和非必需氨基酸),KLE细胞培养于DMEM/F12培养基中,置于37℃ 、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。(2)细胞凋亡率的检测:待细胞生长至对数期后,将细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,然后细胞计数,以每孔细胞数 5× 10的5次方个接种到培养板上,每组设3个复孔。培养24h细胞贴壁后分别加入不同浓度的apicidin,终浓度分别为0.5、1.0 umol/L。继续培养,分别于4及48h后,收集消化的细胞于离心管中,用300目尼龙滤网过滤,离心,弃去上清液,加人4ml磷酸盐缓冲液,再次离心。加人annexin V  5ul及PI5 ul,避光放置15min;加人150ul缓冲液,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用Cellquest软件获取荧光信号并分析凋亡率。(3)蛋白印迹法(western blot)检测HDAC4 和p21的表达量:收集HEEC、HEC-1B、KLE细胞及 0.5umol/L apicidin作用24h后的HEC-1B、KLE细胞各1×10的7次方个,离心后加人细胞裂解液100淤,破解30min,离心取上清液,Bradford比色法测定蛋白质浓度。取30ug蛋白与 2× 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodedcyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上样缓冲液混匀,煮沸6min,上样后进行SDS-PAGE。电泳结束后用半干式转移装置将蛋白从凝胶转移到聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene difuoride,PVDF)膜上,将膜放在含5%脱脂奶粉的缓冲液中室温下封闭PVDF膜2h。1:500稀释兔抗人HDAC4 、p21抗体于5ml 5%脱脂奶中,封闭的膜放于其中,4℃ 孵育过夜。洗膜,加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶ 2000),并以β-actin为内参照;洗膜,加人发光液 2ml,用数码成像系统进行图像拍摄和处理,用Adobe Photoshop CS4软件得出各蛋白条带的表达量G实验重复 3次。

 3统计学方法:采用SPSS13.0软件进行数据的统计分析,所得结果以x± s表示,采用方差分析比较apicidin对 HEC-1B、KLE细胞凋亡率的影响;采用方差分析、t检验比较 apicdin对各种细胞HDAC4和 p21表达量的影响,两两比较采用LSD法。

二、结果

1.apicidin诱导子宫内膜癌细胞凋亡的情况:随着 apicidin作用浓度及时间的增加,两种肿瘤细胞KLE、HEC- 1B的凋亡率均明显升高(P<0.05)。apicidin对KLE细胞和HEC-1B细胞的凋亡诱导作用具有浓度依赖性,同时 apicidin对两种细胞的凋亡诱导作用也具有时问依赖性;且相同浓度的apicidin作用相同时间,HEC-1B细胞的凋亡率低于KLE细胞的凋亡率,分别比较,差异均有统计学意义 (P<0.05)。见表1。

2.各种细胞中HDAC4和p21蛋白的表达:HEEC、HEC- 1B及KLE细胞中HDAC4 的表达呈升高趋势,而p21的表达呈下降趋势,差异均有统计学意义(P<0.01、P=0.OO2)。 0.5umoL/L apicidin作用24 h后的KLE、HEC-1B细胞较对照细胞(即未加药的KLE、HEC-1B细胞)HDAC4 的表达量减少,而p21的表达量增加,分别比较,差异均有统计学意义(P<005)。见图1,表2。

三、讨论

子宫内膜癌的发病率呈上升趋势。目前的研究表明,子宫内膜癌发生的机制包括癌基因突变、抑癌基囚失活、表观遗传学改变等,但具体机制尚不明确[5]。Fakhry等[6] 采用免疫组化方法检测到HDAC1和HDA∞ 在子宫内膜癌组织中比正常子宫内膜组织的表达高,加人两种HDACl即曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)和apicidin可抑制子宫内膜癌细胞的增殖,同时,`1的表达增加、细胞周期蛋白(cyclin) D1和cyclin A的表达下调。张璇等[7]的研究表明,TSA抑制HDAC2的表达并促进P53蛋白的活化与表达,能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

1.HDAC4在子宫内膜癌细胞中的表达:HDAC4 属于第 2类HDAC,其在宫颈癌、卵巢上皮性癌、乳腺癌、膀胱癌中均有表达[8] 。Ahn等[9]的研究结果表明,通过对HDAC4和 HDAG3的负性调节可调控细胞的增殖和凋亡。本研究应用 wcstern  blot检测HDAC4在HEEC、HEC-1B和KLE细胞中的表达情况,结果表明,HDAC4在肿瘤细胞中的表达量高于正常的HEEC,低分化子宫内膜癌细胞KLE中的表达量高于高分化的HEC-1B细胞。这说明HDAC4的表达量在肿瘤细胞中明显升高,推测HDAC4 与子宫内膜癌的发生密切相关,同时,随着肿瘤细胞的分化程度的降低其HDAtH表达水平相应土曾力口。

2.p21在子宫内膜癌细胞巾的表达:p21基囚(又称 p21基因)是eyelin依赖性激酶(CDK)抑制剂家族成员之一,是细胞周期的负调控囚子,是重要的抑癌基因[10]。 Mori等[11] 通过y-分泌酶抑制剂作用于子宫内膜癌细胞,发现细胞增殖减少,同时,p21基因表达增加,eyclinA蛋白表达减少,说明y-分泌酶抑制剂可通过调节p21及cyclin A的表达来影响细胞周期调控及细胞凋亡情况。本研究应用 western  blot检测p21在HEEC、HEC-1B和KLE细胞中的表达情况,结果显示,p21在肿瘤细胞巾的表达量低于HEEC, 且低分化子宫内膜癌细胞的表达量低于高分化,以上结果与 M而等[1l]的研究结果类似。

3. apicidin对子宫内膜癌细胞中HDAC4和 p21表达的影响: apicidin是镰刀菌代谢产物,是一种新型的环四肽类 HDAG,可抑制肿瘤细胞的转移、增殖并促使肿瘤细胞凋亡、分化[3],但对正常细胞无明显影响[12] 。Ahn等[13]将不同浓度的apicidin作用于子宫内膜癌细胞株Ishikawa,对 Ishikawa细胞的抑制作用具有剂量依赖性,可显著上调p21基因和下调cychnA、B1、DI、E及CDK2、4的表达，增加Gl期细胞比例,降低S期细胞比例。

本研究中apicidin作用于两种分化程度不同的子宫内膜癌细胞株HEC-1B及KLE,通过流式细胞仪检测两种肿瘤细胞的凋亡率,结果表明,随着apicidin作用浓度及时间的增加,两种肿瘤细胞的凋亡率升高,并且在相同条件下, HEC1B细胞的凋亡率低于KLE细胞,说明随着肿瘤细胞分化程度的下降其对药物的敏感性增加。通过western blot检测HEEC、HEC-1B细胞和KLE细胞中HDAC4和p21的表达量,结果表明,HDAC4在HEEC、高分化及低分化子宫内膜癌细胞中的表达量呈升高趋势,而p21的表达呈减少趋势, apicidin作用于两种肿瘤细胞后能使HDAC4的表达量下降, p21的表达量上升。说明apicidin发挥作用可能与HDAC4 表达水平下调导致p21的表达增多有关。

综上所述,HDACi apicidin可促进不同类型子宫内膜癌细胞的凋亡,且凋亡率存在时问、浓度依赖性,其可通过抑制 HDAC4 的表达、增加p21的表达而增加子宫内膜癌细胞的凋亡,为临床治疗提供了新思路。HDAC4和p21的表达可能与子宫内膜癌细胞的分化程度有关。本研究尚缺乏apicidin发挥最大作用的适合浓度、最佳作用时问等的结果, 以及对其他类型HDAC影响的结果,这些都需要今后进一步的研究。

[1]丰有吉,沈铿. 妇产科学[M].北京:人民卫生出版社,2007.325-329.

[2] Vogelauer M,Wu J,Suka N. Global histone acetylation and deacetylation in yeast[J].Nature,2000.495-498.

[3] Takai N,Narahara H. Preclinical studies of chemotherapy using histonedeacetylase inhibitors in endometrial cancer[J].Obstet GynecolInt,2010.923824.

[4] Ocker M. Deacetylase inhibitors:focus on non-histone targets andeffects[J].World J Biol Chem,2010.55-61.

[5] Okuda T,Sekizawa A,Purwosunu Y. Genetics of endometrial cancers[J].Obstet GynecolInt,2010.984013.

[6] Fakhry H,Miyamoto T,Kashima H. Immunohistochemical detection of histone deacetylases inendometrial carcinoma:involvement of histone deacetylase 2 in the proliferationof endometrial carcinoma cells[J].Human Pathology,2010.848-858.

[7]张璇,李茗,王泽华. 曲古菌素A对去乙酰化酶2在子宫内膜癌细胞株HEC-1B中表达的影响[J].华中医学杂志,2009.24-27.

[8] Sharma P,Kumar S,Kundu GC. Transcriptional regulation of human osteopontin promoter byhistone deacetylase inhibitor,trichostatin A in cervical cancer cells[J].MolecularCancer Therapeutics,2010.178.

[9] Ahn MY,Chung HY,Choi WS. Anti-tumor effect of apicidin on Ishikawa human endometrialcancer cells both in vitro and in vivo by blocking histone deacetylase 3 and 4[J].InternationalJournal of Oncology,2010.125-131.

[10]隋丽华,高庆玉,张云艳. P16与P21蛋白在子宫内膜癌中的表达及临床意义[J].实用肿瘤学杂志,1999.287-290.

[11] Mori M,Miyamoto T,Yakushiji H,et at. Effects ofN-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)oncell proliferation and apoptosis in Ishikawa endometrial cancer cells[J].HumanCell,2012.9-15.

[12]马晓黎,吴鹏,王蓓蓓. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidin 对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用及机制研究[J].现代妇产科进展,2008.809-812.

[13] Ahn MY,Lee J,Na YJ. Mechanism of apicidin-induced cell cycle arrest andapoptosis in Ishikawa human endometrial cancer cells[J].Chemico-BiologicalInteractions,2009.169-177.