焦磷酸测序技术行子宫颈脱落细胞高危型HPV分型检测的意义

宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤,高危型HPV 持续感染是罹患宫颈癌的直接原囚c目前,高危型HPV 检测方法繁多,但存在一些不足之处。例如,第2代杂交捕获(HC- Ⅱ)技术存在价格昂贵、不能行HPV 分型检测、交叉杂交引起假阳性结果等缺憾[1]。因而,寻求一种新型的高危型 HPV分型检测方法是非常有意义的。焦磷酸测序是—项全新的DNA测序技术,可以快速、准确地测定一段较短的目标 DNA片段,近年来,美国学者将这一技术引人高危型HPV分型检测中[2]。本研究应用该技术对阴道镜门诊收集的 2OO份宫颈脱落细胞标本进行高危型HPV 分型检测,旨在探讨焦磷酸测序技术检测高级别宫颈病变[宫颈上皮内瘤变 (CIN)Ⅱ 以上宫颈病变]的意义。现将结果报道如下。

 —、资料与方法

1.资料来源:(1)宫颈脱落细胞标本:收集2009年l1月至2010年3月在天津市中心妇产科医院阴道镜门诊行宫颈液基细胞学检查(TCT)的200例患者的宫颈脱落细胞标本。 200例患者中,包括基层单位普查时宫颈涂片检查结果为未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)67例、低度鳞状上皮内病变(LSIL)24例、不能除外高度病变的鳞状上皮细胞(ASC-H)15例、高度鳞状上皮内病变(HSIL )23例; 普通门诊就诊时肉眼观察可疑宫颈病变71例。所有患者均未曾行宫颈病变治疗,均接受了TCT、HC-Ⅱ、焦磷酸测序前的巢式PCR技术检测(巢式PCR检测阳性者再行焦磷酸测序),对其中阴道镜检查可疑异常、或普查时宫颈细胞学检查结果为LSIL、HSIL、ASC-H、ASCUS并于本院复查证实、或 HC-Ⅱ检测为高危型HPV 阳性的143例患者行宫颈活检。 (2)细胞系:宫颈癌细胞系SiHa细胞(HPV16阳性)、HeLa 细胞(HPV18阳性)及脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞均购自南京凯基生物科技发展有限公司。(3)主要仪器: PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪为瑞典Boptage AB公司产品,DML 2000型HC-Ⅱ 检测系统购自美国Digene公司。

 2.HC-Ⅱ 技术对宫颈脱落细胞进行高危型HPV 感染状态检测:应用DML20O0型HC-Ⅱ 检测系统检测,具体操作按说明书进行。

3.巢式PCR技术和焦磷酸测序技术对宫颈脱落细胞进行高危型HPV 分型检测:(1)巢式PCR技术扩增筛选HPV 阳性标本:采用酚氯仿法提取宫颈脱落细胞DNA,先将DNA 经HPV 通用型引物MY09和MY11扩增,再将扩增产物经 GP5++和GP6+引物扩增,即完成巢式PCR技术检测,以SiHa 细胞为阳性对照、HUVEC细胞为阴性对照。将巢式PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,以产生150blD产物者为HPV 阳性标本。(2)焦磷酸测序技术检测:将HPV 阳性标本的巢式 PCR扩增产物制各成单链,置PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序,具体操作按说明书进行。对已知HPV16 阳性的SiHa细胞和HPV18阳性的LeLa细胞也同法进行焦磷酸测序。测序引物序列由美国学者Baback Gharizadeh先生提供,由上海生工生物工程技术公司合成。为提高测序效率,将4种高危型HPV 型别的特异性引物置同一测序反应池中,3个反应池中12种高危型HPV 的引物序列见表1。对于巢式PCR技术检测HPV 阳性而焦磷酸测序为阴性的宫颈脱落细胞标本进一步行PCR扩增产物的纯化、克隆,送上海生丁生物工程技术服务有限公司进行双脱氧法DNA 测序。

4统计学方法:采用SPSS17.0软件进行统计学分析。描述性分析用描述性统计(Descriptive Statistics)法,一致性分析采用Kappa一致性检验,组间阳性率比较采用x的平方检验和Fisher检验,等级相关分析采用Kendall等级相关法。

二、结果

1.HC-Ⅱ检测结果:200份宫颈脱落细胞标本中,高危型 HPV 阳性119份,其HPV 检测值为1.04~2120.69ng/L。

2.焦磷酸测序检测结果:焦磷酸测序检测SiHa细胞显示为HPV16阳性,HeLa细胞显示为HPV18阳性,符合这两个细胞系的HPV型别特征。巢式PCR技术检测显示, 200份宫颈脱落细胞标本中高危型HPV 阳性标本113份。对l13份高危型HPV 阳性标本进行焦磷酸测序,结果显示,高危型HPV 阳性98份,包括9个高危型HPV 型别,分别为 HPV16、18、31、33、39 、45、52、58、59。98份高危型HPV 阳性标本中,单一HPV 阳性88份,其中HPV16阳性58份, HPV58阳性12份,HPV18阳性6份,HPV33阳性5份, HPV31阳性2份,HPV45阳性2份,HPV59、HPV39和HPV52阳性各1份;双重HPV 阳性10份,分别为HPV16、 58阳性4份,HPV16、33阳性3份,HPV16、18阳性2份, HPV16、31阳性1份。1份HPV 16、31双重阳性标本是于同一反应池中检测出来的,后经单一引物焦磷酸测序进一步证实。

3.焦磷酸测序与HC-Ⅱ 检测的一致性分析:HC Ⅱ技术和焦磷酸测序技术检测的高危型HPV 感染情况见表2,经Kappa一致性检验显示,Kappa@值为0.791,P<0.01,两种检测方法有很好的-致性。

4高危型HPV 阳性与宫颈病变的相关性200例患者经焦磷酸测序检测显示,102例(其中45例活检后病理诊断、57例阴道镜检查诊断)宫颈正常者中15例(15%, 15/102)高危型HPV 阳性,5例尖锐湿疣者中1例(1/5)高危型HPV 阳性(可能为低危型及高危型HPV 混合感染); 13例CINI者中6例(6/13)高危型HPV 阳性,63例CINⅡ ~ Ⅲ者中59例(59/63)高危型HPV 阳性17例(17/17)宫颈浸润癌患者均为高危型HPV 阳性。经Flshcr精确检验发现,不同病变的患者间高危型HPV 阳性率比较,差异有统计学意义(Fisher值为133.649,P<0.01)。Kendall等级相关法显示,高危型HPV 阳性率与宫颈病变程度呈明显等级相关(Kendall值为0.704,P<0.01)。

 5焦磷酸测序检测的高危型HPV 阳性对宫颈高级别病变的预测价值:经焦磷酸测序检测的高危型HPV 阳性预测宫颈高级别病变的敏感度为95.0%,特异度为65.1%,阳性预测值为77.6%,阴性预测值为91.1%;受试者工作特征 (ROC)曲线下面积为0.800,95%可信区间(CI)为0.721~0.879 ,标准误(SE)为0.040,P<0.01。表明,焦磷酸测序检测的高危型HPV 阳性对于宫颈高级别病变具有较高的预测价值。

6双脱氧法DNA测序结果:对15份经巢式PCR技术检测HPV 阳性而焦磷酸测序高危型HPV阴性的标本进一步行双脱氧法DNA测序,对测序结果经GenBank中的BLAST进行比对,结果显示,7份HPV6阳性,其病理检查结果3例为尖锐湿疣、4例为CIN I;4份HPV11阳性,其病理检查结果1例尖锐湿疣、3例CIN I;3份HPV66阳性,其病理检查结果1例为正常、1例为CIN Ⅱ、1例为CIN Ⅲ ;1份 HPV61阳性,其宫颈活检病理结果为CIN Ⅲ。

三、讨论

高危型HPV 感染是罹患宫颈癌的必要致病囚素。高危型HPV 检测在宫颈癌及癌前病变筛查中起到非常重要的作用:3∶ .由于不同地区高危型HPV 感染可能存在差异,月~不同型别高危型HPV 的致病作用有所不同,因而HPV 分型检测越来越受到重视[4-5]。

1焦磷酸测序用于高危型HPV 检测的意义:近年来,瑞典学者发明了1项新型测序技术——焦磷酸测序技术,适于对已知的DNA片段短序列的测序分析,其可重复性和精确性能与双脱氧法DNA测序相媲美,而速度却大大提高,具各同时对大量样品进行测序分析的能力。美国学者 Charizadeh等[2] 将此技术引入HPV DNA分型检测中,研究者设计了HPV型别特异性焦磷酸测序引物,并应用了前哨碱基识别方法,即将单个碱基比作前哨,提示特异的HPV 型别的存在:为缩短检测时间、提高检测效率并进一步降低成本,研究者还将12种型别特异性引物每4种置于1个反应池中同时进行检测,并发现每个反应池中的引物间无交叉反应,测序中无相互干扰,这样进一步缩短了反应时间,增加了测序通量。

 2焦磷酸测序与HC-Ⅱ检测结果一致性的比较:本研究比较了焦磷酸测序与HC-Ⅱ技术检测高危型HPV 感染的一致性,其Kappa值为0.791,说明两种方法有很好的一致性。 200例患者中,HC-Ⅱ检测高危型HPV阳性有ll9例,而焦磷酸测序检测高危型HPV 阳性仅有朗例,存在此差异的原因可能有以下几个方面:HC-Ⅱ检测作为一种杂交捕获技术,可能存在交叉杂交的问题,即与检测范围之外的HPV 型别的杂交,造成假阳性c本研究还发现,在HC-Ⅱ 检测为高危型HPV 阳性而焦磷酸测序为阴性的病例中有5例HC-Ⅱ 检测值在1~1.5之间,可能存在交叉污染。有研究对同一批标本分别用HC-Ⅱ 和PCR技术检测,结果显示,HC-Ⅱ 检测值在08~15之间者PCR技术检测的阳性率较HC-Ⅱ 检测值>1.5者低,由此认为,临界值附近的结果可信度有所降低,可能是在处理样本过程中样本间存在交叉污染造成的[6] 。

3焦磷酸测序检测高危型HPV 感染对高级别宫颈病变的预测价值:目前,宫颈癌筛查手段有效性的评价是以此种筛查手段检测出高级别宫颈病变的准确性为标准。本研究中,焦磷酸测序技术检测的高危型HPV 阳性识别高级别宫颈病变的敏感度为95.0%,特异度为65.1%,阳性预测值为77.6%,阴性预测值91.1%,ROC曲线下面积为0.800,证实通过焦磷酸测序技术检测的高危型HPV 对识别高级别宫颈病变具有很高的准确性。

本研究中,在15例巢式PCR技术检测HPV 阳性而焦磷酸测序阴性的患者中,经双脱氧法测序检测出12例低危型 HPV 阳性,其中1例HPV61阳性者其宫颈活检病理检查结果为CIN Ⅲ。Mufioz等[7]的研究结果将HPV 61型归为低危型HPV。然而,韩国学者的研究[8]显示,20.5%的HPV61型感染与HSIL相关,2.6%的HPV61型感染发生于宫颈鳞癌患者中。本研究中,双脱氧法DNA测序结果显示,1例HPV61型感染发生于αNⅢ 病变中,HPV61型可能为致宫颈病变的中度危险型HPV ;此外,本研究发现了3例HPV66型感染患者,占1.5%(3/200),高于本研究中所涉及的部分高危型别,可能是本地区HPV 型别分布的特征,因而在以后的研究中可将HPV66 型设计为新的焦磷酸测序型别。

综上所述,焦磷酸测序检测技术可以进行高危型HPV 分型检测,是宫颈癌及癌前病变筛查的有效手段。

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