肾性高血压大鼠肥厚心肌中Pyk2表达和激活的变化及缬沙坦的干预研究

　　作者：吴浩,陈清枝,邢淑华,武维恒,祁春梅　　作者单位：1.徐州医学院第二附属医院 心内科，江苏 徐州 221006;2.徐州医学院附属医院 心内科,江苏 徐州 221002;3.徐州医学院 药理学教研室，江苏 徐州 221002

　　【摘要】目的 以肾性高血压大鼠为模型,研究心肌中富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)的表达情况，探讨缬沙坦逆转左室重构的可能机制。方法 制备两肾一夹肾性高血压大鼠模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组和缬沙坦(30 mg•kg-1•d-1)组，分别于术前及术后第1、4、8和12周测定动脉血压和心肌肥厚指数，用免疫组化法检测心肌组织中Pyk2及磷酸化Pyk2(pPyk2)表达。结果 术后4周心肌肥大已发生,8～12周心肌肥大进一步加重，缬沙坦能显著降低肾血管性高血压大鼠的血压，并能有效抑制心肌肥厚的形成(P<0.01);术后1、4、8和12周大鼠心肌组织Pyk2活性逐渐增加(1周P<0.05，4、8、12均P<0.01);缬沙坦组Pyk2及pPyk2表达水平下降，与同周龄模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 Pyk2及pPyk2在肾性高血压大鼠心肌组织内表达增高，且与心肌肥厚同步;缬沙坦能下调Pyk2及pPyk2的表达。这可能是AT1受体拮抗剂逆转心肌肥厚重构的机制之一。

　　【关键词】 富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶,心肌肥大,缬沙坦,肾性高血压;大鼠;酪氨酸磷酸化

　　Abstract：Objective To study the effects of valsartan on ventricular hypertrophy and the expression of Prolinerich tyrosine kinase 2 (Pyk2) in myocardium of renovascular hypertensive rats(RHR).Methods Twokidney and oneclip(2K1C) renal hypertensive model was established in SpragueDawley rats by chronic partial occlusion of left renal artery.Rats were randomly divided into modeloperation group,shamoperation group and valsartan group.Rats in valsartan group received valsartan 30 mg•kg-1•d-1.Left ventricular mass to body mass ratio was measured to assay the degree of myocardial hypertrophy.Expression of Pyk2 protein and tyrosinephosphorylated Pyk2(pPyk2) were detected by immunohistochemisry. Results Blood pressure(BP)， left ventricular mass to body mass ratio， Pyk2 activity in myocardium of RHR were increased gradually.Valsartan could reverse the high BP level of the model,also the myocardial hypertrophy(P<0.01).Pyk2 levels and the amount of pPyk2 were measured by WesternBlotting,they were evidently increased in the modeloperation group than that of the shamoperation group(1week P<0.05,4 to 12 weeks P<0.01).Pyk2 and pPyk2 levels were significantly dicreased in valsartan group than that of their timematched modeloperation groups(P<0.01).Conclusion Increased expression of Pyk2 and pPyk2 in the left ventricle of RHR is probably associated with the progress of the left ventricular hypertrophy (LVH).The preventive mechanism of valsartan cardiac hypertrophy in RHR is related to the decrease of Pyk2 expression and its activity in cardiac tissue.

　　Key words：Prolinerich tyrosine kinase 2;cardiac hypertrophy;valsartan;renal hypertension; rats;tyrosine phosphorylation

　　高血压时，由于血压长期升高所致的机械刺激及神经体液因素介导产生心肌肥大，肥厚心脏发生一系列结构与功能变化,是大多数心血管疾病的严重阶段。但心肌肥大发生的细胞内信号机制目前尚未阐明。研究其细胞信号转导机制改变及其在发病中的作用具有非常重要的意义[1]。富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)是黏着斑激酶(FAK)家族的新成员,与FAK具有高度同源性,参与细胞和基质成分黏附介导的信号转导[2]。目前研究显示,Pyk2在多种致肥大因子介导的心肌肥大反应中起关键作用,压力负荷致高血压大鼠心肌组织中亦可见Pyk2及磷酸化Pyk2(pPyk2)表达增加[3]。我们主要通过研究两肾一夹肾性高血压大鼠心肌肥大形成不同时期心肌组织Pyk2与pPyk2表达，及其在缬沙坦(valsartan)干预后的变化,从Pyk2激活角度研究Pyk2介导信号途径在心肌肥大发生发展中的作用,为深入研究心肌肥大的发生发展和逆转机制提供新思路和依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料和试剂

　　AntiPyk2 (CAKBETA)和羊抗兔IgGAP均购自Sigma公司，Rabbit (polyclonal) AntiPyk2 [pY402] 购自Biosource公司，DAB购自Sigma 公司，SP免疫组化试剂盒购自美国Zmed公司，其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 实验动物与模型制作

　　雄性SD大鼠,清洁级，体重150～200 g,由徐州医学院实验动物中心提供。实验分为3组,每组8只。SO组为同周龄假手术组(shamoperation group),即对照组;MO组为模型组(modeloperation group)，以戊巴比妥钠腹腔麻醉后制备两肾一夹Goldblatt肾性高血压模型 [4];VO组为缬沙坦组(valsartanoperation group)。缬沙坦粉剂用0.4%羧甲基纤维素(CMC)溶液溶解，浓度为4 mg•ml-1。术后第29天起VO组每天清晨空腹缬沙坦溶液灌胃，剂量为30 mg•kg-1•d-1，连续8周;MO组与SO组等量0.4%CMC溶液灌胃，其余饮食饮水均正常。分别于术前，术后1、4、8、12周测体重、尾动脉血压(HXⅡ大鼠血压心率测定仪，原湖南医科大学心血管生理实验室研制)后将大鼠断头处死。开胸取心脏,以预冷的生理盐水洗去血液,滤纸吸干水分,电子天平准确称量左心室(包括室间隔)质量,计算左心室质量与体质量比值[ω=LVW/BW(mg/g)]。

　　1.3 Pyk2活性测定

　　心肌组织标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片。按照说明使用美国Zmed公司的超敏型SP试剂盒，采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。切片采用LEICA QWin图像处理与分析系统进行灰度测量及半定量分析。每组中选择相对应平面的切片4张，分别使用Pyk2和pPyk2免疫组织化学染色的切片经标准灰密度进行灰度阈值的调整，使背景信号消减，而只有光密度值大于空白对照组切片背景的免疫反应阳性细胞才能被检测到。校正后,每张标本随机测量四周和正中的5个视野,在同等条件下测Pyk2和pPyk2蛋白表达的平均积分光密度(IOD)值(平均总积分减去平均背景积分)。

　　1.4 统计学处理

　　数据以x-±s表示。两组均数的比较采用t检验，多组均数的比较采用方差分析(ANOVA)，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 手术及治疗前后大鼠尾动脉血压变化

　　SO组大鼠术后不同时间平均动脉血压(MAP)无明显差异。MO组术后第1周MAP即开始升高，第4～12周时，MAP水平在170～220 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，除术前及术后第1周外，其余各时点的MAP均显著高于SO组(P<0.01)。VO组在术后第4周开始给药，在给药后第4周(即术后第8周)和给药后第8周(即术后第12周)MAP明显低于MO组(P<0.01)。见表1。表1 手术及治疗前后大鼠尾动脉MAP的改变mmHg与SO组比较，** P<0.01;与MO组比较，△△ P<0.01

　　2.2 各组大鼠ω(LVW/BW)变化

　　SO组大鼠术后各时点ω差异无统计学意义(P>0.05)。MO组术后各时点的ω与SO组相比，除术后1周无明显差异外，其余各时点均明显增加(P<0.05或P<0.01)。VO组在给药后第4周(即术后第8周)和给药后第8周(即术后第12周)ω明显低于MO组(分别为P<0.05和P<0.01)。见表2。表2 各组大鼠ω(LVW/BW)变化mg•g-1与SO组比较,* P<0.05;** P<0.01;与MO组比较，△△ P<0.01

　　2.3 各组大鼠Pyk2活性变化

　　各组免疫组化切片均能在心肌细胞浆中观察到呈阳性的棕黄色部分。与同时点SO组相比,MO组1周Pyk2活性增加21%,4周增加48%,8周增加186%，12周增加202%。提示Pyk2表达增高先于心肌肥厚的发生， Pyk2表达增加幅度随肾动脉狭窄时间延长而加大。MO组不同时间点大鼠心肌Pyk2表达均较SO组明显增加 (1周P<0.05，4～12周P<0.01),而VO组Pyk2活性下降，与同时点MO组相比差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、2。

　　2.4 各组大鼠pPyk2 表达变化

　　各组免疫组化切片均能在心肌细胞浆中观察到呈阳性的棕黄色部分，与同时点SO组相比,MO组1周pPyk2水平增加18%,4周增加47%,8周增加176%，12周增加206%。提示pPyk2水平增高先于心肌肥厚的发生， pPyk2水平增加幅度随肾动脉狭窄时间延长而加大。MO组pPyk2水平第1周就开始增高，一直保持升高到第12周,与同时点SO组相比差异有统计学意义(1周P<0.05;4～12周P<0.01)，而VO组pPyk2水平下降，与同时点MO组相比差异也有统计学意义(P<0.01)。见图3、4。

　　3 讨 论

　　Pyk2在神经组织、造血组织以及小肠、肾、脾、附睾等处表达。许多细胞,包括脑细胞、成纤维细胞、血小板和一些造血细胞都可表达Pyk2。体外培养幼年及成年鼠心肌，内皮素1(ET1)可迅速激活Pyk2;幼年鼠心肌(NRVM)中Pyk2表达高于成年鼠心肌细胞[5]。Pyk2作为一种酪氨酸蛋白激酶,能催化多种含SH同源域2(Src homology2,SH2)的底物蛋白磷酸化,从而将胞外信息与胞内效应分子联系起来,发挥一定的生物学效应,参与细胞的生长、增殖、分化及一些疾病的发生、发展。在体测定肾性高血压大鼠心肌肥厚指标过程中，Pyk2及pPyk2表达变化既往未见报道。两肾一夹肾性高血压大鼠模型属于肾素依赖性的压力型高血压。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是调控心血管反应的重要活性多肽，近年来发现AngⅡ尚具有生长因子特性，AngⅡ通过与AT1受体结合促进心肌细胞生长反应。经过不断研究，有学者提出了AngⅡ与AT1受体结合后引起胞内第二信使激活需要酪氨酸磷酸化的新概念，越来越多的酪氨酸激酶已证实可以被AngⅡ激活，包括Src家族、FAK家族、Jak/STAT家族和受体酪氨酸激酶。离体实验研究证实，这些激酶的激活又与血管平滑肌细胞(VSMC)和以心脏细胞肥大增殖为特征的动脉粥样硬化和心肌肥厚等心血管疾病发病过程密切相关，它们在AngⅡ介导的信号转导通路中起到重要的作用。AngⅡ引起心肌肥厚的信号成分错综复杂，包括G蛋白、蛋白激酶C、转录因子反应蛋白(AP)1、核因子(NF)κB、Janus激酶(JAK)、信号转导和转录激活因子(STATs)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等[67],然而Pyk2在这些信号通路中的作用还未得到很好阐述。Pyk2可催化多种含SH2的底物蛋白磷酸化,从而参与细胞的生长、增殖、分化。一系列因子均可激活Pyk2,如生长因子、G蛋白耦联受体(GPCR)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、紫外线、高渗、AngⅡ、缓激肽等。Pyk2是多成分信号复合物的一部分，包括PKC、Src、MAPK家族三成员及PI3 K[8]，但Pyk2在细胞内的信号转导机制还不清楚。Pyk2与心肌肥厚和心功能衰竭间的密切关系越来越受到人们的重视。最新研究显示，在心肌重塑过程中Pyk2呈慢性长期激活，且能被桩蛋白拮抗[9]，而桩蛋白的磷酸化在AngⅡ刺激VSMC的反应中是最重要的酪氨酸磷酸化事件之一。Pyk2酪氨酸磷酸化和Pyk2酪氨酸激酶激活密切相关[10]，在离体NRVM培养的肥大心肌中，Pyk2磷酸化与Pyk2活化也存在相关性[11]。在其他细胞中还证实，Pyk2磷酸化是由下游信号向MAPK级联反应过渡所必需的。

　　本研究结果显示，各组MAP、ω改变与以往报道[12]相似，AT1受体拮抗剂缬沙坦可使MAP、ω下降,与MO组比较差异有统计学意义(P<0.01),而与SO组比较无差异。肾性高血压大鼠模型主要机制是肾脏缺血、肾素分泌增加及肾素血管紧张素系统被激活。AngⅡ被认为是引起高血压心肌肥厚的主要因素。缬沙坦通过选择性阻断AngⅡ与AT1受体的结合，抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用，从受体水平阻断了AngⅡ的作用，得到降低血压和抑制心肌肥厚的双重作用。本研究发现，在两肾一夹肾性高血压大鼠心肌肥大发生早期，心肌组织Pyk2及pPyk2表达皆增高，且随着心肌肥大的加重表达量继续增加;Pyk2表达升高与ω有高度相关性，AT1受体拮抗剂可有效抑制心肌Pyk2及pPyk2表达的变化。提示AT1受体拮抗剂抑制肾性高血压心肌肥大的机制之一，可能是因为此类药物能下调心肌组织中Pyk2表达及其活性。表明Pyk2的活化参与肾性高血压大鼠心肌肥厚的发生和发展，Pyk2可能是逆转心肌肥厚的一个靶点。进一步研究有必要探明在心肌肥厚过程中Pyk2的独特作用。国内学者运用β1受体反义基因治疗对肾性高血压和左室肥厚有效[13]，该方法值得借鉴。Pyk2非受体酪氨酸激酶介导的信号通路可能是心肌肥大的重要而崭新的信号通路，这一条通路的阐明将为如何调节这些信号分子提供有益思路。

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