雌激素对体外大鼠血小板线粒体功能的影响

　　作者：邱洁 邬加佳 郭开华 作者单位：深圳市第二人民医院妇产科，广东 深圳 518035

　　【摘要】目的 采用大鼠体外血小板，初步探讨雌激素对血小板线粒体的作用，为人体线粒体功能相关研究提供理论基础。方法 应用流式细胞仪和高效液相色谱仪分别检测在雌激素作用下体外血小板在各时间点的线粒体膜电位和ATP变化。结果 在1 h时间点，雌激素组的血小板线粒体膜电位及ATP含量均明显高于对照组(P<0.01)，分别高出23.08%和66.44%。结论 体外血小板应用雌激素孵育，在1 h时间点能短时增强血小板功能。

　　【关键词】 雌激素 血小板 线粒体膜电位

　　目前关于衰老的可能机制主要有氧化应激、兴奋性毒性、能量衰竭、炎症以及细胞凋亡，其中能量衰竭和线粒体功能障碍可能在衰老发展中起重要作用〔1〕。大量研究表明雌激素具有中枢神经的保护作用，雌激素撤退与女性围绝经期后神经退行性变以及AD发病可能存在一定关系〔2〕。对于神经退行性疾病的诊断，目前主要依靠临床症状和评分量表，并辅助影像学检查，但是要明确诊断还需要病理学检查，在临床中难以应用〔3〕。血小板易于采集，且血小板线粒体功能变化在很大程度上能反映神经元以及整个机体的功能，因此可能成为一种简便有效的检测方法〔4〕。本文尝试寻找一种简便有效的替代检测方法以便能更好地诊断神经退行性疾病以及初步探索建立体外血小板线粒体药物作用的模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和分组 2月龄雌性SD大鼠37只，体重200～250 g，由中山大学实验动物中心提供。每笼4～5只大鼠，自然明暗周期，自由取食，自由饮水。①雌性SD大鼠12只用于雌激素作用时间点的体外血小板线粒体膜电位(ΔΨm)检测，用完全随机分组法分为1/2、1、2、4、6、8 h和1、2、4、8、16 d 11个时间组，各时间点分别有空白对照组、苯甲酸雌二醇(EB)用药组2个分组，每个分组6个样本;②雌性SD大鼠25只用于雌激素作用时间点的体外血小板三磷酸腺苷(ATP)含量检测，用完全随机分组法分为1和2 h 2个时间组，1和2 h时间组分别有空白对照组、EB用药组2个分组，每个分组4个样本。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血小板的分离及孵育给药 大鼠以10 g/L的戊巴比妥钠麻醉后，右心室穿刺取血，得到的血样装入含有EDTA的离心管中，即4℃，150 r/min 离心20 min，得到的上清即为富含血小板的血清。血小板计数后，再将血清4℃，300 r/min 离心20 min，弃上清，所得到的沉淀即为血小板，加入相应体积的无血小板血浆(血样4℃，4 000 r/min离心20 min得到的上清)将血小板重悬。血小板采用高倍镜计数，计数板中央一个大方格即400小格的血小板，乘以0.2×109即为每升血液内的血小板数〔5〕，计数后将血小板浓度调整到1×108 ml-1，4℃保存待用。用于雌激素作用时间点的血小板ΔΨm检测：向血小板悬液中分别加入800 μl PBS及1 μl EB，使其终浓度为10-6 mol/L，孵育相应的时间;用于雌激素作用时间点的血小板ATP检测：向1 ml血小板悬液中加入1 μl EB，使其终浓度为10-6mol/L，孵育相应时间。

　　1.2.2 血小板ΔΨm检测 暗室中向流式管中加入2 μl JC1储备液，再缓慢加入血小板及PBS混合液或细胞混悬液，混匀至混合液呈粉红色。孵育20 min后，上流式细胞仪检测。流式细胞仪的设置为FL1 (Florescence Channel 1)的PMT(PhotoMultiplier tube)值为551BP(Band Pass Filter)，FL2的PMT值为536BP。数据用WINMDI软件分析得到红色和绿色荧光的百分率，并计算红色与绿色荧光总和之比。

　　1.2.3 血小板ATP含量的检测 血小板悬液中加入1.6 mol/L HClO4 50 μl，4℃ 15 000 r/min离心5 min，取上清液，再向上清液中加入1.6 mol/L KOH，4℃ 12 000 r/min 离心5 min，取上清液，-80℃保存。采用反相高效液相色谱仪(HPLC)。其色谱条件如下：首先，用150 mmol/L NaH2PO4缓冲液(用KOH将pH调至6.45，过滤并排气)对一4.6 mmi.d.×30 mm，5 μm 粒子大小 hypersil BDS C18 色谱柱进行梯度洗涤。将20 ml的标准液注入色谱仪，以测得其滞留时间(大约13 min)，此期间紫外光波长调至254 nm。之后可注入20 μl样品，通过对比标准液可对滞留时间出现的波峰进行共同色谱分析〔6〕。

　　1.3 统计学分析 数据以x±s表示,采用SPSS11.5统计软件的单因素方差分析(oneway ANOVA)进行多组总体均数的总差异性比较和最小有意义差异(LSD)t检验。

　　2 结果

　　2.1 两组血小板ΔΨm检测结果比较 在1 h时间点上，EB组血小板ΔΨm(1.44±0.10)比空白对照组(1.17±0.10)高出23.08%(P<0.01);在16 d时间点上，EB组血小板ΔΨm(0.54±0.03)比空白对照组(0.62±0.04)低12.90%(P<0.01)。见图1。

　　1)与空白对照组相比：P<0.01

　　图1 雌激素对体外血小板ΔΨm的影响(略)

　　2.2 两组血小板ATP含量的检测结果比较 在1 h时间点上，EB组血小板ATP含量〔(26.43±5.61)μg/ml〕比空白对照组〔(15.88±3.18)μg/ml〕高出66.44%(P<0.01);而2 h时间点上，EB组血小板ATP含量〔(25.42±5.61)μg/ml〕与空白对照组〔(22.82±3.48)μg/ml〕比较无显著差异。

　　3 讨论

　　ATP是一种高能磷酸化合物，主要在线粒体中生成。作为体内最主要的能量载体，ATP可确保体内一切细胞和分子工作正常进行，如：蛋白质合成，胞内外离子稳态的维持，蛋白质的折叠、选择、转运及水解，内质网和高尔基体的正常运作的维持，突触传递的维持等〔7〕。ΔΨm是指线粒体内膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差，是ATP合成和释放的动力，是评价线粒体功能的敏感指标〔8〕。氧化应激和脂质过氧化会破坏线粒体膜并削弱呼吸酶功能，且氧自由基的增加和呼吸链酶的损伤可分别或协同作用，导致质子外移或电子回漏，使得ΔpH和ΔΨm降低。ΔΨm的降低导致渗透性转换孔(PTP)开放。PTP的开放可完全消除残余ΔpH，并加剧ΔΨm的减少。ΔΨm是ATP合成的动力，它的减少不可避免地导致胞内ATP浓度的减少。因此，ΔΨm能够反映线粒体的活性，而ATP含量直接反映线粒体的功能。本实验结果显示在1 h时间点上，EB组的血小板ΔΨm和ATP含量显著高于空白对照组，而其他时间点未发现该变化。动物实验和人体实验均发现，雌激素受体(ER)α和ERβ在巨核细胞和血小板中均有表达，而且ERβ比ERα数量更多。雌激素可以调控ER本身的核基因转录(通过测量mRNA的表达)，还可以调控其他蛋白质和酶类受体，如整合蛋白αⅡB，整合蛋白B3，CD34，血小板衍生的生长因子，组织因子通道抑制剂，基质金属蛋白酶和一氧化氮合酶。这些基因组的影响会决定个体的血小板表型〔9〕，进而影响血小板的聚集和ATP的分泌。血小板虽然没有细胞核，但是含有类固醇激素受体，因此激素作用于血小板的机制并非通过核基因转录，也称之为非基因组作用，包括RNA稳定性的调控，酶的活化(如一氧化氮合酶和细胞色素氧化酶等)或离子通道的活化。这些作用可以影响其他受体作用于血小板功能的阈值、敏感性和/或持续时间。如从男性体内得到的血小板用17β雌二醇孵育后，由凝血酶诱导表达的整合蛋白αⅡBβ3和血小板聚集能力均增强〔10〕。已经证实，ERβ存在于血小板膜上而不是在胞质内，但是血小板线粒体中是否存在ER还在研究中〔11〕;有研究证实ERα和ERβ在其他细胞的线粒体中都存在，因此也很有可能存在于血小板中〔12〕。如果ERβ确实存在于血小板线粒体中，那么这些受体可能会在血小板衰老的功能变化过程中发挥作用，这也可以与衰老的氧化应激机制联系起来。

　　本实验说明EB对血小板线粒体功能具有一定的保护作用，防止线粒体膜去极化，防止氧化损伤和ATP合成减少，维持细胞功能;通过增强氧化磷酸化降低ATP酶的活性，从而增强线粒体呼吸效率，降低其负荷，维持ATP水平。另外，本实验还间接验证了血小板线粒体中ER的存在。

　　总之，血小板线粒体在体外的凋亡过程，能一定程度上模拟神经细胞等有核细胞线粒体的凋亡过程，其在体外的功能变化能一定程度上反映有核细胞的功能变化。本实验结果提示体外血小板线粒体加入线粒体保护作用的药物能短时增强血小板功能。

　　【参考文献】

　　1 Troen BR.The biology of aging〔J〕.Mt Sinai J Med，2003;70(1):322.

　　2 VillaroyaPastor MT.Profile of Alzheimer′s disease in women〔J〕.Rev Neurol，2001;32(12):117881.

　　3 Andersen N，Sjǒgren M，Blennow K.CSF marker for Alzheimer′s disease：total tau，phosphotau and Aβ42〔J〕.World J Biol Psychiat，2003;4(4)：14751.

　　4 Merlo Pich M，Bovina C，Formiggini G,et al.Inhibitor sensitivity of respiratory complex Ⅰ in human platelets：a possible biomarker of ageing〔J〕.FEBS Lett，1996;380(12):1768.

　　5 周剑涛，姚正国.基层医院实用临床检验方法〔M〕.武汉：湖北科学技术出版社，2003：203.

　　6 Edenbrandt CM，Murphy S.Adenine and guanine nucleotide metabolism during platelet storage at 22℃〔J〕.Blood，1990;76：188492.

　　7 Hoyer S.Oxidative metabolism deficiencies in brains of patients with Alzheimer′s disease〔J〕.Acta Neurol Scand，1996;165(Suppl):1824.

　　8 Xu J，Shi C，Yew DT,et al.Effects of betaamyloid peptide and estrogen on platelet mitochondrial function of SpragueDawley rats〔J〕.Platelets，2007;18(6):4608.

　　9 GavrilovaJordan LP，Price TM.Actions of steroids in mitochondria〔J〕.Semin Reprod Med，2007;25(3):15464.

　　10 Jayachandran M，Karnicki K，Miller RS,et al.Platelet characteristics change with aging：role of estrogen receptorβ〔J〕.J Gerontol Biol Sci，2005;60(7)：8159.

　　11 Moro L，Reineri S，Piranda D,et al.Nongenomic effects of 17βestradiol in human platelets：potentiation of thrombininduced aggregation through estrogen receptorβand SRC kinase〔J〕.Blood，2005;105(1)：11521.

　　12 Yang SH，Liu R，Perez EJ,et al.Mitochondrial localization of estrogen receptor beta〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2004;101(12)：41305.