氨磷汀对化疗药物抗宫颈癌HeLa细胞的影响

　　作者：王根菊 韩国荣 作者单位：东南大学医学院附属南京第二医院 妇产科,江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的：评价氨磷汀(amifostine)对不同化疗药物抗宫颈癌HeLa细胞的影响。方法：用MTT法分别测定顺铂、长春新碱、依托泊甙和丝裂霉素对体外培养的HeLa肿瘤细胞系的抑制作用,实验组加化疗药前30 min经600 mg·L-1氨磷汀处理,对照组则只用化疗药物处理,余同实验组,培养后比较两组细胞增殖的抑制率。结果：用氨磷汀在体外加药前30 min加入HeLa肿瘤细胞的实验组,与对照组比较，两组肿瘤细胞抑制率无显著性差异(P>0.05)。结论：氨磷汀不影响顺铂、依托泊甙、丝裂霉素和长春新碱对HeLa肿瘤细胞的抑制作用。

　　【关键词】 氨磷汀 依托泊甙 丝裂霉素 顺铂 长春新碱 化学治疗 HeLa细胞

　　使用任何细胞保护剂都有保护肿瘤的潜在风险，理想的细胞保护剂应是确保对正常组织起选择性保护作用,而不影响抗肿瘤的疗效[1]。目前研究表明广谱的细胞保护剂氨磷汀对正常组织的保护作用是肯定的，但是对于肿瘤的保护作用不能完全排除[2]。为了检测细胞保护剂氨磷汀对化疗药物抗肿瘤作用的影响,我们观察比较了体外应用丝裂霉素(MMC)、顺铂(DDP)、长春新碱(VCR)和依托泊甙(VP16)4种药物单独应用及与氨磷汀联合应用对人宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用,现将结果报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂

　　含10%小牛血清的RPMI 1640培养液由中山医科大学微生物教研室提供。

　　1.2 抗癌药物

　　MMC为日本明智药厂产品，DDP为山东齐鲁制药厂产品,VCR为广州明兴制药厂产品，VP16为西安光华药厂产品,以上药物均稀释成30倍的峰浓度(PPC)，分装后-20 ℃保存备用。化疗药物用药浓度采用血浆的PPC为参照,DDP以4倍的梯度由低到高，MMC、VCR、VP16以2倍的梯度递增。

　　1.3 氨磷汀及HeLa细胞

　　氨磷汀由南京振中生物工程有限公司提供，HeLa细胞由中国科学院上海细胞研究所提供。

　　1.4 仪器

　　核蛋白检测仪为SPECERA MAX250型。

　　1.5 实验方法

　　用MTT法检测氨磷汀对VP16、MMC、DDP、VCR在体外抑制HeLa细胞增长的影响，将复苏的HeLa 细胞接种于10%小牛血清RPMI 1640培养液中置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱，0.25%胰酶消化传代，每2天传代1次，试验时取对数生长期细胞。实验组：将质量浓度为600 mg·L-1的氨磷汀200 μl培养液作用于96孔板的HeLa细胞(3×103孔-1),培养30 min后吸去全部培养液,再分别加入不同浓度DDP、MMC、VCR 和VP16 200 μl培养液到96孔板中培养3 d,每孔加入5 g·L-1MTT 20 μl继续培养4 h,轻轻吸出上清液,加入1 mmol·L-1HCl和异丙醇(1∶10)，用核酸蛋白检测仪于波长570 nm处进行检测。生长抑制率=(1实验组OD值/对照组OD值)×100%

　　对照组不加氨磷汀，余步骤同实验组。

　　1.6 统计学处理

　　采用SAS软件处理，行方差分析。

　　2 结 果

　　氨磷汀对不同浓度的MMC、DDP、VP16、VCR作用于HeLa细胞抑制率的影响见表1。

　　表1显示,随着化疗药物浓度的增加，对HeLa细胞的抑制也明显增强。MMC组和VP16组显示,化疗药物在联合使用氨磷汀时对肿瘤细胞增殖的抑制率较单独应用稍有升高;VCR组显示,在联合使用氨磷汀时对肿瘤细胞增殖的抑制率较单独应用稍有下降;DDP组单独应用与联合使用氨磷汀时没有显示明显的规律性。但4种化疗药物单独处理组与加入氨磷汀600 mg·L-1组比较,抑制率没有明显差异(P>0.05)。以上结果表明氨磷汀对HeLa细胞无保护作用,也不降低化疗药物对细胞的杀伤效果。表1 氨磷汀对不同质量浓度化疗药物作用于HeLa细胞生长抑制率的影响

　　3 讨 论

　　宫颈癌是危害妇女生命健康的常见恶性肿瘤,手术和放射治疗是治疗宫颈癌的主要手段,但随着宫颈肿瘤体积的增大,术后盆腔淋巴结转移、脉管癌栓等病理高危因素增加,术后生存率下降。同时由于原发灶大,易侵入深肌层,且肿瘤内乏氧细胞增多,放疗敏感性下降,放疗难以控制,这促使人们去寻找更多的治疗途径。化疗可缩小肿瘤体积,改善乏氧状况,增加肿瘤细胞对放射的敏感性,对于不能手术者,化疗后部分患者可获得一期手术机会,化疗还可治疗隐匿转移灶。很多化疗药物疗效与剂量呈正相关，提高剂量对肿瘤的杀伤作用明显提高，但疗效提高的同时，也显示明显的毒性作用。多年以来，人们一直在探索如何避免和减轻化疗药物在宫颈癌的治疗过程中对正常组织的毒副作用,以提高化疗的效果，更加有效地治疗宫颈癌。

　　20世纪中期发现氨磷汀是广谱的细胞保护剂[3]。氨磷汀作为一种亲核性的前体物质通过膜碱性磷酸酶的作用，脱磷酸转变成有活性的形式WR1065(游离硫醇)而起作用。其入体内后经细胞膜上结合的碱性磷酸脂酶作用,即可转化为细胞渗透性的具有游离巯基的活性代谢物，磷酸脂酶的活性与pH值成正比。而肿瘤细胞多是厌氧代谢,pH值范围较低,导致对正常组织有更高的选择,因此在治疗剂量下正常组织中WR1065比肿瘤组织中浓度高出很多,同时WR1065有很强的消除化疗产生的自由基能力,并能和烷化剂、铂剂及其活性代谢产物直接结合并脱毒,由于这些原因,氨磷汀能消除化疗的毒副作用,且不降低化疗的疗效，从而达到选择性保护正常细胞的目的[4]。

　　本实验参考了一些研究者的数据[56],选用600 mg·L-1氨磷汀来研究在体外与DDP、VP16、MMC和VCR联合应用及化疗药物单独应用时对HeLa肿瘤细胞的化疗疗效。MTT法结果可靠，简便易行。实验结果显示，联合氨磷汀组作用时与化疗药物单独处理组的宫颈癌细胞增殖无差异，表明氨磷汀对宫颈癌细胞无保护作用,也不降低化疗药物对宫颈癌细胞的抑制率。总之，目前所作的研究证实，氨磷汀作为一种广谱的细胞保护剂，对正常组织有明确的保护作用，同时本实验结果又显示其不影响对宫颈癌细胞的杀伤效果，在宫颈癌治疗中有很好的临床应用前景，值得进一步研究开发和临床推广，但是联合氨磷汀应用时，对于各药的剂量、浓度和作用时间还值得进一步探讨和研究。

　　【参考文献】

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　　[2]BRIZEL D M,OVERGAARD J,Doseamifotine have a role in chemoradiation treatment[J].Lancet Oncol,2003,4(6):378381.

　　[3]CAPIZZI R L.The preclinical basis for broadspectrum selective cytoprotection of normal tissue form cytotoxic therapies by amifostine [J].Semin Oncol,1999,26( 2 suppl 7):321.

　　[4]MARZATICO F,ROTACMORONI M.In vitro antioxidant properties of amifostine (WR2721,Ethyol)[J].Cancer Chemother Pharmacol,2000,45(2): 172176.

　　[5]PIERELLI L C M,FATTOROSS B.In vitro effect of amifostine on haematopocetic progenitore exposed to carboplatin and non alkylating antineoplastic drug: haematoprotection acts as a drug specific progenitor reuse[J].Br J Cancer,1998,78(88):10241029.

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