羊水细胞培养用于产前细胞遗传学诊断177例分析
发表时间：2010-08-05 浏览次数：396次
作者：卢守莲 作者单位：南京医科大学第一附属医院 妇产科,江苏 南京 210029
【摘要】 目的：应用羊水细胞培养对孕中期孕妇进行产前诊断，预防染色体病。方法：采用羊水细胞培养、常规染色体制备、G 显带技术，对177 例具有产前诊断指征的孕妇进行染色体核型分析。结果：6 例21三体，1 例45，X，3 例平衡易位，诊断结果与随访情况一致。结论：羊水细胞培养进行产前诊断是十分安全而可靠的。
【关键词】 产前诊断 羊水细胞培养 染色体异常
近年来，产前诊断的技术发展迅速，取材来源更趋于多样化，如从母亲外周血富集的胎儿细胞或DNA、植入前的囊胚、孕早期的绒毛细胞、孕中期的羊水细胞以及脐带血等。诊断的方法包括运用细胞遗传学分析染色体核型、运用分子生物学检测基因、运用生化方法检测各种酶的含量等[1]。不过，其中许多方法和技术并不成熟，在临床上推广的难度较大。相对而言，在孕中期运用羊水细胞学检查进行产前诊断是比较具有临床价值的。本研究中，我们总结了从2003年以来的177 例孕中期羊水细胞学检查结果，结合其临床情况，研究分析运用羊水细胞学检查行产前诊断的临床意义。
1 对象和方法
1.1 研究对象
177 例孕妇均来自遗传咨询门诊，对每例接受产前诊断的孕妇详细询问病史、进行家系调查及必要的体检等。孕妇年龄22 45岁。其中，90例是产前生化筛查胎儿唐氏综合征高风险孕妇，43例高龄孕妇，12例是有唐氏儿分娩史孕妇，5例为平衡易位携带者，4例为产前生化筛查18三体儿高风险，6例孕妇B超提示畸形儿，4例孕妇有畸形儿分娩史。2例为医疗性性别鉴定，3例为产前生化筛查其他异常(指单一生化指标明显异常，如βhCG MoM值在4.0以上者)。另外，无明显医学指征但孕妇要求行产前诊断者6例，试管受精(IVF)并行产前遗传学诊断后妊娠2例。
1.2 穿刺时间和方法
177例孕妇羊膜腔穿刺时间在孕龄17 26周。羊膜腔穿刺术前均行B超检查了解胎儿大小、发育情况、胎盘位置等。摇腹3 min后B超定位下穿刺，抽出羊水20 ml送检。
1.3 实验室方法
抽出羊水离心后，细胞沉渣接种入培养基。培养基为杭州贝因美公司提供的羊水细胞全培养基。置5%CO2、37 ℃恒温箱中进行开放式培养，收获制片按本遗传室方法操作。G显带后镜下观察每张片子，记数分散良好的中期分裂像20 30个，分析3 5个。
2 结 果
2.1 羊水细胞培养
177例羊水细胞培养成功175例，成功率98.9%，培养失败2例，表现为细胞生长不良。另外，有7例血性羊水，在换液时用生理盐水充分洗涤培养瓶，仍然获得了足够的可供分析的细胞分裂像，取得满意的诊断结果。
2.2 羊水细胞核型分析情况
177例羊水细胞培养成功行核型分析者中发现异常10例，异常检出率为5.6%;6例三体为主要的染色体异常，均为21三体;性染色体数目异常1例;平衡易位3例。以产前生化筛查胎儿唐氏综合征高风险为指征的，有3例检出异常核型;以高龄为指征的，有2例检出异常核型;以B超提示畸形儿为指征的，有1例检出异常核型;以平衡易位携带者为指征的，有3例检出异常核型。详细情况见表1。
表1 胎儿羊水细胞染色体核型异常情况
病例孕妇年
龄/岁孕周指征羊水细胞核型胎儿随诊情况13318产前筛查胎儿唐氏综合征高风险47，XY，+21引产，脐血检查符合羊水细胞核型22918平衡易位携带者46，XY，t(4;10)孕足月分娩，外周血检查符合羊水细胞核型32917唐氏儿分娩史46，XY，der(14;21)(q10;q10)，+21引产，脐血检查符合羊水细胞核型42919罗氏易位携带者45，XY，der(14;21)(q10;q10) 引产54218高龄孕妇47，XX，+21引产，脐血检查符合羊水细胞核型64520高龄孕妇47，XX，+21引产，脐血检查符合羊水细胞核型72921产前筛查胎儿唐氏综合征高风险47，XX，+21引产83018罗氏易位携带者45，XX，der(14;21)(q10;q10) 孕足月分娩，胎儿外观无异常92623B超提示畸形儿45，XO孕足月分娩，外周血检查符合羊水细胞核型102520产前筛查胎儿唐氏综合征高风险47，XY，+21引产
2.3 孕妇及胎儿情况随诊
行羊膜腔穿刺术的177例孕妇一般情况好，未见羊水栓塞、胎盘早剥、阴道流血、胎膜早破、胎儿损伤及感染等并发症。除选择性引产外,无一例妊娠丢失。
3 讨 论
3.1 羊膜腔穿刺术在产前诊断中的应用
产前诊断是当前遗传病诊断学的焦点所在。在产前及时、安全、准确地诊断胎儿遗传病，有利于临床医生和产妇共同协商、选择恰当的处理方案。产前诊断的方法多样，包括细胞遗传学、生化遗传学以及分子遗传学等。其中通过羊膜腔穿刺、培养羊水细胞、进行核型分析的细胞遗传学方法诊断胎儿染色体核型异常，是目前临床上使用最广泛的一种方法。
羊膜腔穿刺是一种通过B超引导，经腹部穿刺羊膜腔收集羊水的方法。1966年，Mark Steele和Roy Breg首次从羊水中分离出羊水细胞且培养成功，并对经培养的细胞进行核型分析。此后，这一技术不断改进，其安全性、准确性得到了进一步提高，且适用范围日益扩大。我们在实际工作中深刻地体会到，只要严格遵循操作规范，积极探索操作方法，运用羊膜腔穿刺开展产前诊断具有非常高的临床价值。
羊膜腔穿刺作为一种创伤性诊断方法，其对母亲和胎儿的影响是导致孕妇及其家属焦虑的主要原因。据文献报道，孕中期羊膜腔穿刺的流产率在0.5% 1%[2]。为了减轻创伤，我们严格控制操作指征，努力预防感染，术后密切随访，及时处理潜在风险。在我们的临床操作中，并没有发生术后流产的情况。
一般而言，在孕中期(16 18周)行羊膜腔穿刺效果较好。过早穿刺，羊水细胞数量不足，对胎儿损伤较大;过迟穿刺，羊水细胞活力减弱，培养效果欠佳[3]。为了尽量满足临床需要，通过不断摸索实验方法，我们选择适当的培养基，改善操作技术，目前已对多名超过24孕周的孕妇成功施行了羊膜腔穿刺、产前遗传学诊断。
3.2 羊水细胞核型分析诊断唐氏综合征
唐氏综合征又称21三体综合征，也称为先天愚型。患者多余的21号染色体破坏了基因组遗传物质间的平衡，导致了发育异常。其临床表现多样，以智力低下最为突出。该病是产前遗传诊断中最常见的疾病，其在新生儿中的发病率为1/600[4]。在妊娠过程中，患该病的胎儿更容易流产、死产，因此孕中期的检出率应高于新生儿[5]。在我们检出的孕中期染色体核型异常的胎儿中，60%的为21三体综合征。
目前，唐氏综合征的发病机制尚不明确。研究发现，在某些特定人群中该病的发生率明显增高，包括：(1)母亲分娩时年龄35岁以上;(2)曾生育唐氏综合征患儿;(3)父母有一方是累及21号染色体罗伯逊易位或其他平衡易位携带者或21号染色体镶嵌体;(4)筛查阳性者。对于这部分人群，是非常有必要开展孕中期产前诊断的[6]。在我们发现的6例患者中，1例既为高龄(45岁)，又生育过唐氏综合征患儿。根据其年龄，风险估算为0.41%;而生育过患儿的，其风险比没有生育过患儿的同龄孕妇高0.42%[7]。1例孕妇本人核型存在累及21号染色体的平衡易位，并分娩过唐氏综合征患儿。还有1例仅年龄为40岁，没有其他风险因素。其余3例为生化筛查阳性。
根据孕妇外周血中部分生化指标的值，估算胎儿患唐氏综合征的风险，筛查出高风险的人群，在此基础上开展产前诊断，这是近20年来产前诊断领域最重要的进展之一[8]。在我国，开展21三体筛查-诊断工作的历史尚短，我们借助的分析软件、数据库和筛查策略等都直接来源于欧美国家。考虑到不同国家和地区之间经济、文化和社会发展的诸多差距以及族群间的生物差异，我们亟需深入讨论唐氏综合征产前筛查-诊断工作的安全性、准确性及其效益与成本等，以促进这一工作在我国的健康开展。
我们采用DELFIA技术测定孕妇血清AFP、Free βHCG的浓度，运用风险评估软件计算胎儿患病风险。风险切割值定为：21三体1∶300，18三体1∶350。风险高于切割值的孕妇建议行羊膜腔穿刺、产前诊断。我们发现的3例唐氏综合征患儿的母亲生化筛查风险值分别为1/140、1/160和1/180。本组生化筛查阳性的90例孕妇中，确诊3例。其阳性预告值(确诊阳性数/筛查阳性数)为3/90，即3.3%，而国外文献报道多为1% 2%[9]，其原因可能是国外文献多为大样本分析，筛查例数往往数万以至超过10万。虽然本组例数有限，不过仍然可以显示，运用目前的产前筛查-诊断方案对于及时、准确地发现唐氏综合征患儿是非常有价值的，值得我们进一步优化、改进和推广。
3.3 其他异常核型的产前诊断
据文献报道，新生儿中染色体异常的发生率为1/150 1/120。其中，21三体发生率最高，其次为性染色体异常和结构性染色体异常[10]。作为临床医生和产前诊断工作者，应努力探寻这些多发性染色体异常疾病的好发因素，及时准确地进行风险评估，有针对性地对高风险人群开展产前诊断。因此如何筛选出高风险人群，这是产前诊断工作中非常重要的环节。筛选的基本原则是一方面尽可能让所有潜在的患者被检出，降低漏检率，另一方面应严格控制接受产前诊断的孕妇例数，以减少诊断过程对产妇身体和心理的不良影响以及医疗资源的不当耗费。45,XO(特纳氏综合征)和47,XXY(克氏综合征)是最常见的两种性染色体疾病。克氏综合征的产前诊断指征不明，多为零星发现。特纳氏综合征患儿经孕期B超检查，多可发现颈部水囊状淋巴管瘤和手足水肿[11]。我们发现的1例特纳氏综合征患儿在孕23周经B超发现颈部水囊状淋巴管瘤。因此如果B超提示胎儿存在颈部水囊状淋巴管瘤样病变，应高度重视，建议产妇接受产前诊断。
染色体易位是结构性染色体异常中最常见的情况。如果易位没有导致遗传物质的丢失，并不表现出病理特征，即为平衡易位。亲代中一方若为平衡易位携带者，其子代核型可能出现3种情况：(1)正常;(2)表型正常的平衡易位携带者;(3)不平衡易位[12]。出现不平衡易位的胎儿往往流产，如果存活，常表现为不同程度的畸形或发育缺陷。因此夫妇双方中一方为平衡易位携带者的，也应建议接受产前诊断。我们对5例亲代中一方为平衡易位携带者的胎儿进行产前诊断，结果3例为平衡易位。其中1例孕妇自行引产，另2例胎儿出生后，并没有发现表型的异常。
产前诊断作为胎儿医学非常重要的一个领域，日益受到临床医生和广大孕产妇的关注。经羊膜腔穿刺、培养羊水细胞、开展产前诊断的技术虽然相对安全、有效，但如何准确界定适用指征、改良细胞培养技术，尤其是如何更加精确描述染色体结构异常乃至基因的缺失、突变等，仍待我们进一步深入探索。
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