妊娠肝内胆汁淤积症对围生儿不良影响的可能机制研究

　　作者：杜雪寒,蒋犁 作者单位：徐州市第一人民医院 妇产科，江苏 徐州 221002

　　【摘要】 目的：探讨妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)对围生儿的不良影响及其可能机制。方法：临床收集ICP和正常妊娠孕妇各30例，采集孕妇外周静脉血，分离血清;比较新生儿体重、身长，胎盘重量，羊水粪染和Apgar评分情况。随机选取正常妊娠脐带，行脐静脉内皮细胞分离培养，用两种血清刺激培养的内皮细胞，MTT法检测内皮细胞活力，ELISA法检测内皮细胞分泌血管内皮生长因子的变化。结果：ICP患者娩出的新生儿体重、胎盘重量和Apgar 1min评分明显低于正常孕妇组，羊水粪染率明显高于正常孕妇组，有统计学差异。MTT法发现随着血清浓度的增加，内皮细胞的OD值逐渐降低，两两比较有统计学差异;ICP组各浓度点OD值均低于相应正常孕妇组，P<0.05。ELISA法发现：同正常孕妇组血清相比，ICP组血清HUVECs表达分泌型VEGF蛋白减少;随着血清浓度的升高，VEGF蛋白表达逐渐降低，有统计学差异。结论：ICP对围生儿产生不良影响。ICP围生儿预后不良可能与血管内皮细胞VEGF的分泌减少有关。

　　【关键词】 妊娠肝内胆汁淤积症;围生儿;脐静脉;血管内皮细胞;血管内皮生长因子

　　妊娠肝内胆汁淤积症 ( intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种多发生于妊娠晚期的妊娠特有疾病，以患者出现皮肤瘙痒、胆酸升高和肝功能异常为特点。该病对孕妇的影响相对较轻，但是围生儿的患病率和死亡率非常高，可引起严重的胎儿窘迫、羊水粪染和胎儿生长受限。有研究者认为，ICP发生时胎盘血流灌注不足导致了胎儿缺氧。胎盘血管的发育受血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等的调节，VEGF具有刺激新血管发生与生长及维持血管壁完整性和通透性的作用，在胎盘血管形成及胎儿生长发育方面起着重要的作用。本研究选取ICP患者和正常妊娠孕妇各30例，测量新生儿体重、身长，胎盘重量，检查羊水粪染情况，行Apgar评分，观察ICP对围生儿的不良影响。以ICP患者血清刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，检测细胞活力和VEGF蛋白的分泌量，探讨围生儿不良预后的可能机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料收集2003年5~12月在东南大学附属中大医院和南京市妇幼保健院妇产科住院的正常妊娠孕妇和ICP患者各30例，无菌抽取孕妇肘前静脉血，测量新生儿体重、身长，胎盘重量，检查羊水粪染情况。从正常孕妇组中随机选取脐带(剖宫产术中)。纳入标准：正常妊娠组，整个孕期无合并症或并发症。ICP组，ICP诊断标准遵照《中华妇产科学》[1]，并排除合并妊高征、糖尿病、肾病、原发性高血压、贫血及其它内科合并症。正常妊娠孕妇及ICP组患者均为单胎初产妇，其年龄、孕次、孕周均相匹配，差异无显著性(P>005)。孕龄诊断正确，均为36~38周未临产而行剖宫产者。否认有吸烟、激素治疗史。正常妊娠组系因骨盆、胎位、珍贵儿及社会因素等而行手术。

　　1.2 方法剖宫产术中目测羊水性质，羊水污染程度按Odriscoll法分度。剖宫产断脐后立即称量新生儿体重(净重)、测量身长，行Apgar评分，并称量胎盘的重量(脐带于根部钳夹切断，距离胎盘<2cm)。参照Jaffe法行HUVECs原代培养(获取脐带后无菌条件下用磷酸盐缓冲盐水充分洗涤脐静脉腔，向静脉腔内灌注01%胶原酶，置于37℃水浴中消化8min，收集消化液并离心，弃上清即可得脐静脉内皮细胞),当细胞融合60%~80%时，加入不同浓度的ICP患者血清(血清浓度为0、5%、10%、15%和20%)刺激24h，以正常妊娠孕妇血清对照，MTT法检测HUVECs活力，按照ELISA试剂盒操作步骤检测培养上清液中分泌型可溶性VEGF的变化。

　　1.3 试剂和仪器RPMI Medium 1640培养基(GIBCO BRL公司产品)，胎牛血清(100ml·瓶-1，杭州四季青公司生产)，Ⅳ型胶原酶(H&Y biochemical corporation公司产品)，MTT粉剂购自Sigma公司，ELISA试剂盒购自晶美生物工程北京有限公司;GBB16型CO2培养箱，OLYMPUS CK2型倒置显微镜，SPECTRA MAX250型酶联免疫检测仪，96孔培养板。1.4 统计方法组间多个样本间比较采用方差分析，两两之间比较用q检验，两样本比较用成组t检验，羊水污染率的比较采用两样本χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 两组孕妇一般情况比较ICP组及正常孕妇组(各30例)孕妇均为单胎、初产，在年龄、孕次、孕周方面数值相当，均无统计学差异(P>0.05)。血清胆汁酸(甘胆酸)水平ICP组[(1221.923±784.505)ng·dl-1]明显高于正常孕妇组[(104.735±38.765)ng·dl-1]，P<0.05。

　　2.2 围生儿情况比较ICP患者和正常孕妇所生新生儿的体重、身长、Apgar评分以及胎盘重量具体数据见表1(Apgar评分满分为10分，8~10分为正常，其中ICP组死胎1例)。两组羊水粪染情况比较见表2(Odriscoll法分度：羊水清亮;羊水呈浅绿色为Ⅰ度;羊水黄绿色、浑浊为Ⅱ度;羊水稠厚、呈棕黄色为Ⅲ度。将羊水Ⅱ度或Ⅲ度污染定义为羊水粪染)

　　。2.3 ICP患者血清对HUVECs活力的影响HUVECs与正常孕妇血清共培养24h，随着血清含量的增加，细胞OD值逐渐增加(P<0.05);而ICP组OD值却逐渐降低，组内两两比较有统计学差异(P<0.05)，5%和0浓度除外。同浓度两组细胞OD值比较：ICP组明显低于正常孕妇组，组间两两比较有统计学意义(P<0.05)，具体数值见表3。 表1 两组新生儿体重、身长，胎盘重量及Apgar评分情况的比较注：两组粪染阳性率比较，P<0.05;括弧中为理论频数

　　2.4 ICP患者血清对HUVECs分泌VEGF的影响HUVECs与不同浓度的ICP患者或正常孕妇血清共培养24h，各标本根据其吸光度值在标准曲线上得出相应VEGF蛋白含量，具体数据及比较见表4。ICP组血清VEGF蛋白量均分别低于相应浓度的正常孕妇组，方差分析q检验示两两间均有统计学差异。表3 不同浓度的两组血清干预24h HUVECs的OD值比较

　　3 讨 论

　　ICP是一种妊娠特异性疾病，严重影响围生儿预后。Palmer等[2]报道ICP胎儿窘迫率为20%~35%、围生儿死亡率63‰~110‰、新生儿窒息及死亡率12‰~119‰。有研究者[3]发现ICP患者所分娩的足月新生儿体重明显低于正常对照组，同时ICP羊水胎粪污染明显增高，可高达58.3%。本实验结果也证明，ICP患者所生新生儿出生体重明显低于正常妊娠孕妇(排除孕周及其它影响新生儿体重因素)，有统计学差异。ICP影响胎儿的生长发育，可能与胎儿缺氧和营养获取减少有关。当胎儿存在慢性缺氧时，羊水胎粪污染明显增加，本实验把羊水Ⅱ度以上粪染当成是胎儿缺氧及窘迫的一个指标，结果表明ICP组羊水粪染率高达33.33%，是正常组(10%)的3.33倍。推测ICP组胎儿慢性缺氧发生率高于正常妊娠组。新生儿Apgar评分1min两组间有显著差异，其中ICP组死胎1例，5min无显著差异，这可能与临产前行剖宫产术减少宫缩对胎儿的影响和新生儿娩出后进行积极有效的抢救有关，但这并不能说明ICP的新生儿窒息率已和正常无异。目前认为围生儿预后不良与缺氧缺血有关，缺氧缺血的实质是血管的发育和功能异常导致血、氧的供应和摄取不足。胎盘血管的发育和功能维持是由一系列生长因子参与调节的，又以VEGF的作用最重要，VEGF的异常可能使血管发育和功能异常而导致围生儿缺血缺氧。 VEGF在胎盘血管形成及胎儿生长发育中起重要的作用[4]。众多研究发现在妊娠全过程中胎儿、胎盘均有较高的VEGF及其受体的表达[56]，其在胎盘中表达量的变化与胎盘血管的发育相一致。妊娠早期VEGF促进胎盘血管网络的发育;妊娠晚期主要发挥调节血管完整性和通透性的作用[7]，维持母胎之间的营养交换。妊娠晚期胎盘VEGF表达量与胎盘重量及胎儿大小均呈正相关。本试验中ICP患者所生新生儿体重和胎盘重量明显低于正常妊娠组。本实验通过ICP患者的血清与HUVECs共培养模拟ICP胎儿的宫内环境，发现HUVECs分泌和表达VEGF蛋白减少，HUVECs活力降低，细胞数量减少，表明细胞受到损害。血管内皮细胞的受损，可能与内皮细胞表达和分泌VEGF蛋白的功能降低有关。VEGF蛋白量的减少则使细胞增殖、血管生发、血管通透性和内皮细胞的完整性受到影响，造成血管内皮细胞受损。而内皮细胞受损，使VEGF的表达更降低。胎盘血管生成减少和血管通透性的降低，导致胎盘胎儿间有效交换量降低，胎儿在宫内处于缺氧状态，从而产生一系列围生儿预后不良的并发症。

　　【参考文献】

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