早期宫颈癌局部浸润与临床预后关系的研究

　　作者：张凡 常永霞 张九鸿 舒丽莎 陈江平 刘军超 林媛媛 张剑虹 赵秀芳 成日青 作者单位：(1.河北北方学院附属第一医院病理科,河北 张家口 075000;2.张家口市探机医院内科,河北 张家口 075000;3.河北北方学院附属第一医院妇产科,河北 张家口 075000)

　　【摘要】 目的：探讨早期宫颈癌中局部浸润及其预后意义。方法：应用免疫组织化学检测65例早期宫颈癌中MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin，并利用原位杂交检测HPV的表达，分析其与临床参数和预后之间的关系。结果：MMP2的表达与组织学分型、淋巴结转移、局部复发有关(P<0.05)，与UICC分期无关(P>0.05);MMP9的表达与淋巴结转移、局部复发有关(P<0.05),与组织学分型、UICC分期无关(P>0.05);CathepsinD的表达与组织学分型、淋巴结转移、局部复发、UICC分期均存在相关(P<0.05);Ecadherin的表达与淋巴结转移、UICC分期有关(P<0.05)，与局部复发、组织学分型无关(P>0.05);HPV的表达与组织学分型有关(P<0.05)，与淋巴结转移、局部复发、UICC分期无关(P>0.05);经多因素Cox比例风险模型分析显示：组织学分型、CathepsinD、MMP2的表达与早期宫颈癌患者术后生存率有关(P<0.05)。结论：MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin参与了早期宫颈癌的局部浸润;组织学分型、MMP2、CathepsinD的表达可作为宫颈癌患者独立的预后因素。

　　【关键词】 宫颈癌;浸润;免疫组化;CathepsinD;预后

　　Retrospective Study on Local Invasion Associated with Proteins Expression

　　and Clinical Significance in Early Cervical Carcinoma

　　ZHANG Fan, CHANG Yongxia, ZHANG Jiuhong, et al

　　Department of Pathology,The First Affiliated Hospital,Hebei North Universtity,Zhangjiakou,075000,Hebei,China

　　【ABSTRACT】 Objective: To investigate the local invasion and clinical significance in early Cervical Carcinoma.Methods: The expressions of proteins MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin were detected by immmunohistochemistry method,the expression of HPV was detected by in situ hybridization in sixtyfive patients with early Cervical Carcinoma who were followed up more than ten years.The relationship between the expression of invasion associated with proteins and clinical prognosis were analysed. Results: the expression of MMP2 was associated with lymph node metastasis, histological grading and recurrence (P<0.05)，were not associated with UICC staging(P>0.05); the expression of MMP9 was associated with lymph node metastasis and recurrence (P<0.05)，was not associated with histological grading 、UICC staging(P>0.05);the expression of CathepsinD was associated with all parameters (P<0.05);the expression of Ecadherin was associated with lymph node metastasis and UICC grading (P<0.05)，was not associated with recurrence 、histological staging(P>0.05); the expression of HPV was associated with histological staging (P<0.05)，was not associated with lymph node metastasis ， UICC grading， recurrence (P>0.05); in the multivariate Cox analysis, survival rate was correlated with histological staging MMP2 CathepsinD (P<0.05). Conclution: MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin all take part in invasion of early cervical carcinoma; Histological staging MMP2, CathepsinD can be regarded as independent prognostic factors in early cervical carcinoma.

　　【KEY WORDS】 Cervical carcinoma;Invasion;Immunohistochemistry;CathepsinD;Prognosis

　　宫颈癌是目前危害女性健康的常见肿瘤，其局部浸润和淋巴结转移不仅影响手术效果，而且直接关系患者预后。宫颈癌的浸润转移机制尚不清楚，与预后关系研究较少;HPV感染与宫颈上皮的癌变存在密切联系。本实验利用免疫组织化学和原位杂交检测早期宫颈癌中MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin、HPV的表达，希望能为宫颈癌浸润机制的深入研究提供实验依据，并利用多因素Cox比例风险模型对其与早期宫颈癌患者的预后进行分析，为准确评估患者预后提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集河北北方学院附属第一医院1985.1～1995.1月住院患者中临床病理资料齐全，并有10年以上随访结果的宫颈癌65例(随访时间至2004年1月，死亡病例均死于宫颈癌相关病变)，所有病例均为原发早期宫颈鳞状细胞癌，都进行了宫颈癌手术治疗，未作术后化疗、放疗等辅助治疗。年龄25～69岁，平均年龄51岁。无淋巴结转移21例，淋巴结转移44例。无局部复发42例，局部复发23例。按TNM分期标准进行临床分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例。资深病理医师对切片进行复习确诊，采用最新Reagan等建立的分类;大细胞非角化型癌(高分化)8例，角化型癌(中分化)39例，小细胞非角化癌(低分化)18例。

　　1.2 免疫组织化学染色

　　所有标本经10%甲醛常规固定,石蜡包埋,4μm连续切片。MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin一抗试剂均购自北京中山试剂公司。主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗(采用专用微波炉进行抗原微波热修复)，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1h，DAB显色10～15min，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞<10%为阴性,>10%为阳性。MMP2、MMP9、CathepsinD阳性表达定位在肿瘤细胞质，Ecadherin阳性表达定位在细胞膜。采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取5个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性单位，取其均数即为该切片的着色强度，所有的结果都以均数±标准差表示。

　　1.3 原位杂交染色

　　HPV16/18原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物试剂公司。主要步骤：切片常规脱蜡入水，3%H2O2室温处理10min，蒸馏水洗涤5min×3次;胃蛋白酶消化，37℃温箱中50min，PBS洗涤5min×3次;滴加预杂交液，40℃温箱中2h，吸取多余液体，不洗，滴加含探针的杂交液，盖专用盖片，40℃温箱中过夜;在37℃水浴中用2×SSC洗涤5min×2次，0.5×SSC洗涤10min×1次，0.2×SSC10min×1次;滴加封闭液，37℃温箱中30min，吸取多余液体，不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃温箱中60min，PBS洗涤5min×4次;滴加SABC，37℃温箱中30min，PBS洗涤5min×32007年2月张 凡等：早期宫颈癌局部浸润与临床预后关系的研究第1期2007年2月河北北方学院学报(医学版)第1期表1 MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin、HPV在各组中表达阳性率的比较表2 MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin、HPV表达与临床病理参数的相关分析 注：rP2代表MMP2，rP9代表MMP9，rD代表CathepsinD，rE代表Ecadherin，rH代表HPV次;滴加生物素化过氧化物酶，37℃温箱中30min，PBS洗涤5min×4次。DAB显色，光镜下观察，自来水中终止反应。苏木素复染，充分水洗，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明、封片。阳性定位于细胞核。

　　1.4 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标表达水平与临床病理参数之间作直线回归相关分析，对全部病例用Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析，并对有预后价值的指标作KaplanMeier生存曲线。以α=0.05作为具有统计学意义。

　　2 结果

　　65例宫颈癌病例中，MMP2阳性率为78%(51/65)，MMP9阳性率为75%(49/65)，CathepsinD阳性率为6%(37/65)，Ecadherin阳性率为40%(26/65)，HPV的阳性率52%(34/65)。MMP2、MMP9在淋巴结转移组、UICC Ⅱ期组分别高于淋巴结未转移组、UICC Ⅰ期组;CathepsinD在低分化组、UICC Ⅱ期、局部复发组分别高于高分化组、UICC Ⅰ期、局部未复发组;Ecadherin在低分化组、淋巴结转移组、局部复发组分别高于高分化组、淋巴结未转移组、局部未复发组;HPV在低分化组高于高分化组，在淋巴结未转移组、UICC Ⅰ期分别高于淋巴结转移组、UICC Ⅱ期(见表1)。

　　各指标的着色强度与肿瘤的各临床病理参数之间做直线回归相关分析显示：pgp的表达与肿瘤分化程度、局部复发及UICC分期有关(P<0.05)，与淋巴结转移无关;TopoⅡ的表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，与局部复发、肿瘤分化程度、UICC分期无关(P>0.05);GSTπ的表达与肿瘤分化程度、局部复发、淋巴结转移及UICC分期均存在相关(P<0.05);TS的表达与淋巴结转移、UICC分期有关(P<0.05)，与肿瘤分化程度、局部复发无关(P>0.05)(见表2)。

　　对随访资料进行单因素Cox模型分析，结果显示早期宫颈癌肿瘤分化程度、淋巴结转移、UICC分期及MMP2、CathepsinD、Ecadherin的表达均与术后生存之间明显相关( P<0.01)。多因素Cox模型分析结果显示：只有组织学分型、MMP2、CathepsinD的表达与术后生存时间之间存在明显相关(P<0.05)，即肿瘤分化程度越低、MMP2、CathepsinD表达水平越高，患者的术后生存时间越短，生存率越低(图1～图3)。

　　3 讨论

　　国际妇产科医师联合会认为影响宫颈癌的预后因素包括淋巴结转移、肿瘤三维体积、肿瘤浸润深度。肿瘤浸润深度小于3mm时5年生存率为99%，但当浸润深度大于19mm时5年生存率仅为63%;肿瘤体积小于2cm3时5年生存率大于90%，肿瘤体积大于30 cm3时5年生存率小于65%，肿瘤体积的增大也意味肿瘤浸润深度增加，与患者预后呈负相关[1]。早期宫颈癌的局部浸润机制的研究较少报道，浸润对预后意义研究尤其少。MMP2、MMP9、组织蛋白酶D与多种肿瘤的浸润密切相关;钙粘连蛋白在肿瘤发展的各个阶段出现不同水平的表达;HPV的感染已成为宫颈癌发生以及原位癌进入到浸润癌的关键因素，本实验探讨上述各指标在早期宫颈癌浸润中的表达情况，以及与患者预后之间的关系，从而为深入研究早期宫颈癌的浸润转移机制提供初步理论依据，并为宫颈癌的预后评估提供可靠的判断指标。

　　MMPs是一族至少包括19类的锌依赖性内肽酶，它们的共同作用可降解所有的细胞外基质成分。MMPs主要以酶原形式分泌到细胞外，一般情况下它们与组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)以1∶1比例结合形成复合物。体内的MMPs具有基因转录水平、翻译后水平调节，MMP2和MMP9分子量分别为 72Kda和92KDa，是两种重要的蛋白酶，与多种肿瘤浸润和转移密切相关[2,3]。同时研究显示MMP2、MMP9与肿瘤血管生成相关[4～6]。因此推测两者的表达直接影响肿瘤患者预后。我们实验中MMP2的阳性表达率为78%， MMP9的阳性表达率为75%，而且在肿瘤组织浸润的边缘存在MMP2、MMP9的高表达，而在肿瘤内部表达水平较低，同时两者的表达水平与淋巴结转移、临床分期密切相关，因此MMP2、MMP9的促浸润和血管化作用使肿瘤更易获取营养，便利肿瘤发展和浸润转移，单因素和多因素分析显示MMP2可作为早期宫颈癌临床预后的独立指标。

　　组织蛋白酶D(CathepsinD CD)为一种分子量为52KD的糖蛋白,存在于乳腺癌细胞,亦存在于乳腺组织间质中,它能降解基底膜促进肿瘤的浸润转移、刺激癌细胞生长。Do NY对397例乳腺癌冰冻标本,用Westernblot法对CD测量,发现高水平的CD,尽管在淋巴结阴性情况下,乳腺癌患者容易早期复发或较早期死亡,认为CD可作为预后的独立指标[3]。Ortiz Mendoza CM用免疫组化方法对281例乳腺导管浸润癌研究,对病人进行74个月随访发现,CD高表达尽管与淋巴结、受体或绝经等情况无关,但其提示生存期短、预后差[7]。Myo K等认为CD的纤溶酶原的水解片段有抑制血管生成作用，缺氧导致的环氧化酶2的高表达对CD有明显的抑制作用，使的后者的抗血管生成作用受抑制，血管密度增加[8]。我们实验中CD的阳性率为56%，其表达水平与肿瘤分化程度、临床分期、局部复发密切相关，肿瘤分化低、临床分期晚、局部肿瘤复发时CD出现高表达;多因素分析显示CD可作为早期宫颈癌的独立预后指标。

　　Cadherin是一族依赖细胞外Ca2+的细胞粘附受体,介导同种亲和性的细胞—细胞间粘附,并参与建立和维持细胞间连接,他们广泛分布于上皮细胞、间胚层细胞和胎盘等处，对维持上皮细胞结构形态的完整性、极性形态和组织结构起关键作用[9，10]。Ecadherin(Ecad)在细胞分裂、粘附和肿瘤早期浸润中有调控作用,其阳性表达有抑制肿瘤转移的功能,其表达降低或缺失,会破坏粘着连接,使肿瘤细胞间的粘附性减弱易于脱落或迁移,而向外周浸润性生长或转移,这已在多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、大肠癌、膀胱癌、肝癌等)的研究中得到证实[11]。我们实验Ecad的阳性率为40%，同时肿瘤细胞在部分浸润癌出现表达缺失，部分病例出现高表达，推测上皮恶变后细胞粘附力降低，利于肿瘤细胞从原发灶脱落，同时局部出现浸润转移的细胞必须相互粘附才能形成浸润灶，向远处转移;且表达水平与肿瘤的组织分型、淋巴结转移、局部复发密切相关，但统计分析显示Ecad不能作为早期宫颈癌的独立预后指标。

　　20世纪70年代中叶以来，HPV逐渐被视为宫颈肿瘤形成病因学的关键因素。早期研究显示宫颈鳞状细胞癌中HPVDNA的检出率超过60%，其中HPV16所占比例最高(50%以上)，HPV18为15%，HPV45和HPV31分别为9%、6%[12～14]。HPV基因组包含三个区，即早期基因区和晚期基因区。早期基因区编码多种蛋白质，其中E6和E7是保守序列，在所有HPV相关病变中都有表达，能够诱导细胞增生和转化。我们实验中HPV的阳性率为52.3%，与报道接近，同时其表达水平与宫颈癌肿瘤细胞的分化密切相关，已有的文献也支持我们的结论。HPV16阳性宫颈癌患者5年生存率58%，HPV18阳性者为38%，说明HPV与患者的预后相关，但我们的实验未得出HPV为宫颈癌患者的预后指标，可能与我们选取的病例均为早期宫颈癌患者有关。

　　【参考文献】

　　1 Branca M, Ciotti M, Giorgi C,et al. Matrix metalloproteinase2 (MMP2) and its tissue inhibitor (TIMP2) are prognostic factors in cervical cancer, related to invasive disease but not to highrisk human papillomavirus (HPV) or virus persistence after treatment of CIN[J].Anticancer Res， 2006，26(2):15431556

　　2 Zhai Y, Hotary KB, Nan B,et al. Expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase is associated with cervical carcinoma progression and invasion[J].Cancer Res, 2005,65(15):65436550

　　3 Do NY, Lim SC, Im TS. Expression of cerbB receptors, MMPs and VEGF in squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Oncol Rep, 2004,12(2):229237

　　4 TalvensaariMattila A, TurpeenniemiHujanen T, Puistola U. Matrix metalloproteinase 9 and relapse in patients with early stage squamous cervical carcinoma[J].Int J Gynaecol Obstet, 2005,91(1):7576

　　5 Daniel D, Chiu C, Giraudo E, et al. CD4+ T cellmediated antigenspecific immunotherapy in a mouse model of cervical cancer[J].Cancer Res, 2005,65(5):20182025

　　6 Giraudo E, Inoue M, Hanahan D. An aminobisphosphonate targets MMP9expressing macrophages and angiogenesis to impair cervical carcinogenesis[J].J Clin Invest, 2004,114(5):623633

　　7 Ortiz Mendoza CM, Acosta Sanchez NA, Catarino Dircio A.Pyometra as a complication of invasive endocervical cancer[J].Ginecol Obstet Mex, 2006,74(2):121124

　　8 Myo K. Prediction of occult cervical lymph node metastasis in patients with stage ⅠⅡ squamous cell carcinoma of the oral cavity[J].Kokubyo Gakkai Zasshi, 2006,73(1):100106

　　9 Thompson LD, Wieneke JA, Heffess CS. Diffuse sclerosing variant of papillary thyroid carcinoma: a clinicopathologic and immunophenotypic analysis of 22 cases[J].Endocr Pathol, 2005,16(4):331348

　　10Nomine Y, Masson M, Charbonnier S,et al. Structural and functional analysis of E6 oncoprotein: insights in the molecular pathways of human papillomavirusmediated pathogenesis[J].Mol Cell, 2006,21(5):665678

　　11Castellsague X, Diaz M, Sanjose S,et al. Worldwide human papillomavirus etiology of cervical adenocarcinoma and its cofactors: implications for screening and prevention[J].J Natl Cancer Inst, 2006,98(5):303315

　　12Branca M, Giorgi C, Ciotti M,et al Relationship of upregulation of 67kd laminin receptor to grade of cervical intraepithelial neoplasia and to highrisk HPV types and prognosis in cervical cancer[J].Acta Cytol, 2006,50(1):615

　　13Bergeron C, Cas F, Fagnani F,etal. Human papillomavirus testing with a liquidbased system: feasibility and comparison with reference diagnoses[J].Acta Cytol,2006,50(1):1622

　　14Ravazoula P, Androutsopoulos G, Koumoundouroul D,et al. Immunohistochemical detection of HPV proteins and cerbB receptors in cervical lesion specimens from young women[J].Eur J Gynaecol Oncol,2006,27(1):6972