HLAG和HIF1α在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义

　　作者：郭立丽,刘正清,张丽萍,郭广玲 作者单位：郧阳医学院附属太和医院 1.妇产科，2.泌尿外科,湖北 十堰 442000

　　【摘要】 目的：探讨人类白细胞抗原G (HLAG)与缺氧诱导因子1α(HIF1α)在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法：　应用免疫组化SP法检测HLAG、HIF1α在58例上皮性卵巢癌、30例卵巢良性肿瘤及20例正常卵巢组织中的表达，并分析它们与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系。结果： 与卵巢良性肿瘤、正常卵巢组织相比，上皮性卵巢癌组织 HLAG和HIF1α蛋白阳性表达率都增加，差异有统计学意义(P<0.05)。HLAG和HIF1α阳性表达呈正相关(r=0.269，P <0.05)，HLAG阳性表达与肿瘤病理分级、临床病理分期相关(P <0.05)。结论：　HLAG和HIF1α在卵巢癌生长、浸润、转移过程中发挥了一定作用，可作为判断卵巢组织恶性程度及评估不良预后的重要指标。

　　【关键词】 类白细胞抗原G;缺氧诱导因子1α;卵巢肿瘤;免疫组织化学

　　Expression and clinical significance of human leucocyte antigen protein G and hypoxia inducible factor – lα in epithelial ovarian carcinoma

　　GUO Lili, LIU Zhengqing, ZHANG Liping, GUO Guangling

　　(1.Department of Obstetrics and Gynecology; 2.Department of Urology, Taihe Hospital Affiliated to Yunyang Medical College Shiyan 442000,China)

　　[ABSTRACT] Objective: To investigate the expression of human leucocyte antigen protein G(HLAG)and hypoxia inducible factor – lα(HIF lα) protein in human epithelial ovarian carcinoma,and to evaluate their clinical implications. Methods: The expression of HLAG and HIF1α protein in 200 cases of normal ovarian tissue, 30 cases of benign epithelial tumors and 58 cases of epithelial ovarian carcinoma were determined by SP immunohistochemical method，and the relationship with clinicopathological parameters were analyzed. Results:　 The positive rate of HLAG and HIF1α protein in tumor tissues was significantly higher than those in benign tumor tissues and normal tissues (60.3% and 65.5%) (P< 0.05).There were no significant differences in HLAG expression considering age, histology type and lymph node metastasis (P> 0.05), while its expression was correlated with histological grade and FIGO stage ⅢⅣ (P < 0.05). The HIF1α expression was significantly related with histological grade, regional lymph node metastasis and FIGO stage ⅢⅣ(P < 0.05), but not with age,and histology type (P> 0.05). In additional,the expression of HLAG was positively correlated with HIF1α expression in epithelial ovarian carcinoma (r=0.269，P < 0.05). Conclusion: HLAG and HIF1α play important roles in growth, invasion and metastasis of ovarian epithelial carcinoma, and may be a useful predictor of poor prognosis.

　　[KEY WORDS] HLAG;HIF1α;Ovarian neoplasms; Immunohistochemistry

　　人类白细胞抗原G ( human leucocyte antigen proteinG，HLAG) 是近年发现的一种非经典性的MHC I类分子，具有免疫抑制功能，参与母胎免疫耐受的形成。近年研究表明，在一些恶性实体肿瘤组织中可检测到较高水平HLAG异位表达，提示肿瘤细胞可能通过抑制NK细胞及T细胞而产生抗肿瘤免疫，从而逃避机体免疫监视而发生浸润及转移[1]。缺氧诱导因子1 (HIF1)是一个异源二聚体转录因子，其介导转录的基因涉及能量代谢、血管新生以及多种细胞因子合成等方面，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥着重要作用[2]。本研究采用免疫组织化学法对上皮性卵巢癌组织中HLAG与HIF1α的表达进行检测，并与正常卵巢组织及良性卵巢肿瘤组织比较，旨在探讨HLAG与HIF1α在上皮性卵巢癌中的表达、临床意义及相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本与试剂

　　选取2005年6月～2009年6月于本院就诊的卵巢癌患者58 例，经病理检查均证实为上皮性卵巢癌。病理分级: G1 18 例, G2 28例, G3 12例;手术病理分期: Ⅰ～Ⅱ期20例, Ⅲ～Ⅳ期38例;病理类型: 浆液性癌35例，黏液性癌8例，宫内膜样癌10例，透明细胞癌3例，未分化癌2例;盆腔淋巴结转移31例。所有患者手术前均未接受过抗肿瘤治疗。另取同期本院存档正常卵巢及卵巢良性肿瘤作为对照。上述石蜡标本连续切片, 厚4～5μm,均经HE染色和病理检查确诊。

　　兔抗人HLAG多克隆抗体及免疫组化链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶( SP)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB )显色剂、抗原修复液均购自武汉博士德生物有限公司。HIF1α多克隆抗体购自北京中山生物科技有限公司。

　　1.2 方法

　　参照SP试剂盒说明书，以已知阳性切片组织作为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。应用免疫组化SP法检测HLAG、HIF1α在58例上皮性卵巢癌、30例卵巢良性肿瘤及20例正常卵巢组织中的表达，并分析它们与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系。

　　1.3 判定标准

　　HLAG阳性判定标准如下：以胞浆和胞膜出现棕黄色颗粒为HLAG阳性表达，其表达的判定以染色强度和阳性细胞百分率的得分之和进行评估。其中染色强度0=无,1=弱阳性,2=中等阳性,3=强阳性;阳性细胞百分率0=无阳性细胞,1=阳性细胞数<25%,2=阳性细胞数25%～50%,3=阳性细胞数50%～75%,4=阳性细胞数>75%。HIF1α阳性细胞判定根据染色程度和染色细胞百分率进行分级：瘤细胞胞核出现棕色颗粒聚集为阳性细胞。当阳性细胞数超过瘤细胞数的1%则定为阳性表达。阳性细胞<1%者为(-)，1%～10%者为(+)，11%～50%者为(),>50%者为();低度表达为(+)，中度表达为()，高度表达为();两项之和:0为(-)，2为(+)，3～4为()，5～7为()。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。以χ2检验和Spearman等级相关分析阳性表达的意义、表达之间相关性及与临床病理参数的关系。P< 0. 05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同性质卵巢组织中HLAG、HIF1α的表达

　　正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中, HLAG表达分别为5.0%、13.3%;而在卵巢上皮性癌组织中HLAG表达率高,阳性表达率为60.3% (35/58),其中18例(+)、13例()、4例()。卵巢癌组织中HLAG蛋白的阳性表达率高于卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05);而卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织HLAG 表达差异无统计学意义(P >0.05)(表1)。

　　正常卵巢组织HIF1α无阳性表达，卵巢良性肿瘤组织HIF1α阳性表达率为6.7%，上皮性癌组织中HIF1α阳性表达率为63.8%(37/58)，明显高于正常及良性肿瘤组织，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。表1 不同性质卵巢组织中HLAG、HIF1α的表达(略)注：与正常组相比,*P< 0.05;与良性肿瘤组相比，△P<0.05。

　　2.2 不同临床病理参数的卵巢上皮性癌组织中HLAG、HIF1α的表达

　　在不同类型的卵巢癌组织中HLAG蛋白阳性表达率分别为：浆液性卵巢癌62.9%，黏液性卵巢癌75.0%，宫内膜样癌60.0%，透明细胞癌 33.3%，不同类型卵巢癌组织间HLAG蛋白的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。在不同分化程度的卵巢癌中HLAG蛋白阳性表达率分别为：G1 33.3%，G2 67.9%，G3 83.3%，HLAG在低分化组表达率明显高撢高分化及中分化组，差异有统计学意义(P<0.05)，高分化组和中分化组比较差异无统计学意义(P>0.05)。手术病理分期Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ期中HLAG蛋白阳性表达率分别为30.0%、76.3%，差异有统计学意义(P<0.01)。分析表明，HLAG表达与年龄、淋巴结有无转移无关。

　　HIF1α表达与手术病理分期有关，其阳性表达率随着病理分化程度的增高而升高, 且差异有统计学意义(P<0.05)。淋巴结转移组中HIF1α表达明显高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。分析表明，HIF1α表达但与年龄、病理类型无关(P>0.05)(表2)。表2 HLAG和HIF1α在上皮性卵巢癌中的表达与临床病理手段的关系 n(略)注：G1 VS G2，*P < 0.05;G2 VS G3, △P < 0.05;G1 VS、G3, ☆P < 0.05。Ⅰ+Ⅱ期VSⅢ+Ⅳ期，▲P<0.05。淋巴结无转移VS淋巴结有转移，#P<0.05。

　　2.3 卵巢上皮性癌组织中HLAG表达与HIF1α表达的相关性

　　在卵巢上皮性癌组织中,HLAG阳性表达35例,其中9例HIF1α染色强度为(-),8例(+),10例()，8例();阴性表达23例,其中12例HIF1α染色强度为(-),5例(+),4例(),2例()。HLAG阳性表达者HIF1α染色强度高于HLAG阴性表达者,差异有统计学意义(P<0.05)。HLAG和HIF1α表达间有相关性(r=0.269, P <0.05)，但是相关性不密切。

　　3 讨论

　　位于染色体6p21.3区的HLAG是近年发现的一种非经典性的MHCⅠ类分子，是唯一表达于母胎界面滋养层的HLAⅠ类基因，其功能主要为参与母胎免疫耐受形成，保护胎儿逃避母体的免疫监视和免疫攻击。Patti等首先报告在黑色素肿瘤细胞系和标本中有HLAG蛋白转录表达并参与肿瘤逃避，从而引起侵袭和转移[1,3]。HLAG主要通过抑制免疫活性细胞而在肿瘤免疫逃避中发挥关键作用，其与NK细胞、T细胞亚群(如细胞毒性T细胞)、抗原递呈细胞(如树突细胞)、B细胞和单核细胞系等免疫细胞的抑制性受体(如ILT2、ILT4、KIR2DIA等)直接结合，使受体胞浆内的免疫受体酪氨酸抑制序列(immunoreceptortyrosine based inhibitory motif，ITIM)磷酸化，激活后募集含有SH2结构域的酪氨酸磷酸酶(SH2domain comaining tyrosine phosphatases，SHP)SHP1和SHP2，关闭传导信号。NK、T、DC、B等免疫细胞的活性被抑制，使得HLAG阳性的靶细胞免受免疫细胞的裂解，形成肿瘤免疫逃逸[4,5]。此外HLAG还可通过促进细胞因子IL10、IL15等分泌而改变微环境，增强抑制肿瘤免疫反应因素作用。近年皮肤癌、肺癌、肾癌、乳癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤等肿瘤中都发现了HLAG的表达[6,7]。

　　本研究证实HLAG蛋白在上皮性卵巢癌组织的阳性表达率显著高于正常卵巢组织及卵巢良性肿瘤组织，差异有统计学意义(P<0.01)，与文献报道相似[8,9]。HLAG蛋白阳性表达与上皮性卵巢癌病理学分级及手术病理分期有关(P<0.05)，推测HLAG可能参与上皮性卵巢癌的发生、发展过程。HLAG在上皮性卵巢癌中表达情况由肿瘤类型及分化程度所决定，环境因素如缺氧、压力、激素、细胞因子可能参与了HLAG启动子活性调节[10]，同时DNA甲基化、组蛋白乙酰化等分子水平也能影响作用于肿瘤微环境[11]，促使HLAG在卵巢癌组织中表达上调，降低了免疫功能，从而使肿瘤细胞逃避免疫效应细胞的打击，得以发生浸润、转移。HLAG是反映卵巢癌恶性程度和侵袭性程度的辅助性分子标志物，可能成为卵巢癌免疫治疗的新生物学靶点，为临床治疗提供新的思路方法。

　　HIF1是一种细胞低氧反应的核转录因子，1992年由Semenza等在低氧的肝癌细胞株Hep3B的细胞核提取物中发现，它可以上调细胞存活 、生长、分化以及凋亡等基因的表达，尤其在缺氧状态下对氧的平衡起中心作用。HIF1是由HIF1α及HIF1β亚单位构成的异二聚体转录因子，其中HIF1α是唯一的氧调节亚单位 ，它决定HIF1的活性。低氧是肿瘤的一个特征，HIF1α通过活化下游靶基因使肿瘤细胞的葡萄糖转运、糖酵解增加，局部微环境新生血管生成，从而使肿瘤组织逐渐适应乏氧微环境，在肿瘤的发生、发展进程中发挥作用。目前研究表明HIF1α在多数恶性肿瘤组织中都有表达，已证实其在肝癌、乳腺癌、脑肿瘤等多种肿瘤组织中表达并调节其生物学行为[2，12,13]。

　　本研究结果显示上皮性卵巢癌组织HIF1α的阳性表达率显著高于良性卵巢肿瘤组织，提示HIF1α的过表达涉及卵巢癌的发生、发展过程。本研究还发现HIF1α表达与卵巢癌的手术病理分期、临床病理分期有明显相关性，同时在淋巴结转移组表达明显升高，这提示HIF1α过表达与卵巢癌的浸润及进展有关。推测卵巢癌中一些基因的突变活化了癌基因或灭活了抑癌基因产物增加了HIF1α的活性，使HIF1α高表达，激活了其下游靶基因引起级联放大效应，促进血管、淋巴管等生成，为肿瘤浸润、转移提供了环境。因此阻断该通路或抑制HIF1α的表达可能可以阻断肿瘤发展。

　　本研究结果表明，在上皮性卵巢癌中HLAG和HIF1α蛋白表达呈正相关(r=0.269，P <0.05)，提示在上皮性卵巢癌中HIF1α与HLAG可能起协同作用,共同调节卵巢癌的发生。如在缺氧应激状态下，HLAG序列中存在低氧反应元件结合位点HRE，HIF1α与HRE结合后，可能激活HLAG的转录[10，14，15]。此外HLAG可抑制免疫细胞活性，改变肿瘤生存微环境而发挥免疫逃避效应，从而使肿瘤细胞发生浸润、转移。

　　总之，本研究发现在卵巢癌中HLAG和HIF1α表达明显增加，它们参与了肿瘤的浸润及转移。我们可以通过抑制其表达恢复机体的免疫细胞杀伤力，来发挥自身保护作用，排除异己，抑制肿瘤生长过程。这将为晚期卵巢癌的治疗尤其是失去手术机会，且对化疗不能耐受的患者，带来一线新的希望。

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