荧光原位杂交技术在产前诊断21-三体综合征中的应用

　　作者：杨联云

　　【关键词】 荧光原位杂交技术

　　自1969年报道采用同位素标记的探针进行核酸序列原位杂交以来，该技术很快被广泛应用，而荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是原位杂交技术大家族中的一员,它通常是用生物素或地高辛标记探针，通过荧光染料结合的检测试剂如抗体进行检测[1，2];也可将荧光染料直接标记的核酸探针用于检测大的靶序列[3]，这种操作所需时间少，背景染色低。该方法目前已从科研实验室逐步进入临床实验诊断领域。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 仪器 离心机，水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜。

　　1.1.2 试剂 荧光探针：购自上海集爱公司的21号染色体的FISH探针。工作液的配制：(1)20×SSC：氯化钠175g，柠檬酸三钠88.2g，加三蒸水到1000ml。(2)变性液：甲酰胺28ml，20×SSC 4ml，蒸馏水8ml，终体积40ml，充分混匀，调整pH至7.0～8.0,密封保存于4℃～8℃,每次使用前均需测定pH值。(3)洗脱液：甲酰胺20ml，20×SSC 4ml，蒸馏水16ml，终体积40ml。(4)SSCT：20×SSC 100ml，Tween-20 0.2ml，加二蒸水至终体积为1000ml。

　　1.2 方法

　　1.2.1 羊水细胞涂片的制备 抽取羊水5～6ml，1500rpm离心10min，去上清，留羊水细胞沉淀;在细胞沉淀中加3ml 0.25%trypsin(溶于无CaCl2的Hanks液)，37℃消化30min;2000rpm离心10min，去上清，在沉淀中加入4～5ml 0.75mol/L KCl,37℃孵育30min，再加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)，轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加5ml固定液，轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加适量固定液，滴片。

　　1.2.2 杂交、洗脱、显色 (1)将pH为7.0～7.5的变性液(70%甲酰胺/2×SSC)放入水浴中预热至74℃,将一支干净的温度计插入变性液中以确认温度达到了74℃，注意冷玻片插入变性液中将降低变性液的温度。(2)将玻片插入预热的变性液中3～4min，不要摇动，然后迅速将玻片插入预冷至-20℃的酒精中，依次从70%、90%到100%酒精中各脱水2min。(3)将探针于37℃保温5min，轻轻振动后短暂离心收集液体于管底(不要变性探针)。(4)用刻字笔将标本周围划线，加上10μl探针。盖上盖玻片，在盖玻片周围封上一层rubber cement，将玻片置于湿盒中于37℃杂交过夜。(5)在水浴中预热40ml洗脱液(50%甲酰胺/2SSC)至43℃，将一支干净的温度计插入洗脱液中证实温度达到43℃。(6)用镊子小心地除去rubber cement，小心揭开盖玻片，将玻片插入洗脱液中洗脱10min，然后再重复一次。洗脱液的温度对于信号强度与特异性非常关键，洗脱液温度不能低于43℃。以免由于交叉杂交导致背景产生。(7)将玻片在37℃的2×SSC中洗脱2次，每次4min。(8)将玻片置于室温SSCT液中洗脱2min。(9)将玻片取出，用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，不要让玻片干掉，以免由于检测试剂的非特异性结合导致高背景荧光。(10)在每块玻片上加上30μl avidin-FITC，盖上盖玻片，37℃孵育20min。(11)小心去除盖玻片，将玻片在室温SSCT中洗脱3次，每次2min。(12)用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，加上30ml Anti-avidin于标本上，盖上盖玻片，37℃孵育20min。(13)小心去除盖玻片，在室温的SSCT中洗脱3次，每次2min。(14)在每块玻片上加上30μl avidin-FITC，盖上盖玻片，37℃孵育20min。(15)小心去除盖玻片，在室温的SSCT中洗脱3次，每次2min。(16)用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT加上10μl DAPI，盖上18mm×18mm盖玻片，用一块纸巾盖上盖玻片,小心挤压纸巾以吸去多余的DAPI,注意不要移动盖玻片。

　　2 结果

　　在荧光显微镜下观察结果：Down综合征有3条21号染色体，所以，在荧光显微镜下有3个荧光信号。见图1。

　　3 讨论

　　对于染色体异常的诊断，传统的细胞遗传学方法往往采用细胞培养与染色体显带分析法，该法所得结果的可靠性取决于收获的中期分裂相的数量，染色体分散和显带的质量。20世纪90年代以后，随着分子生物学技术的提高以及向各学科的渗透，出现了一种新的运用分子手段分析染色体异常的方法，即：染色体荧光原位杂交(FISH)技术，该技术不仅可用于中期分裂相，还可在间期细胞显示杂交信号，尤其适用于那些培养难以成功的各种组织细胞[4，5]。本文在参考国内外多种方法的基础上[6～8]，利用荧光素标记的探针直接对21-三体综合征进行FISH分析，并已建立了一套稳定的FISH方法。FISH与常规的染色体显带分析法相比，有如下优点：快速、不需体外培养、在极短的时间内可检测大量细胞;可对那些分散不好的分裂相做出明确诊断;能分析一部分显带染色体技术不易分辨的异常，如复杂易位、倒位、微小缺失、复杂畸变等;敏感性和特异性非常高。因此，FISH技术可应用于间期细胞中染色体异常的分析尤其是产前诊断各种染色体异常。值得注意的是，间期FISH只能检出染色体的数目异常，而对于结构异常，则无法进行诊断，所以，FISH的结果并不是最终诊断，必须同时进行细胞培养，进行染色体结构异常的分析，但由于间期FISH具有快速简便和准确性高等特点，作为传统的细胞遗传学诊断的辅助手段，具有很好的临床应用价值。

　　(本文彩图见封三)

　　【参考文献】

　　1 Andrews K,Wienberg J,FergusonSmith MA,et al.Enrichment of fetal nucleaed cells from matermal blood:model testsystem using cord blood.Prenatal Diagn,1995,15:913-919.

　　2 Busch J,Huber P,Pfluger E,et al.Enrichment of fetal cells from maternal blood by high gradient magnetic cell sorting (double MACS) PCRbased analysis.Prenatal Diagn,1994,14:1129-1140.

　　3 Van Wijk IJ,Van Vugt JMG,Mulders MAM,et al.Enrichment of fetal trophoblast cells from the maternal peripheral blood followed by detection of fetal deoxyribonucleic acid with a nested x/y polymerase chain reaction.Am J Obstet Gynecol,1996,174:871-876.

　　4 Von Koskull H,Gahmberg N.Fetal erythroblasts from maternal blood identified with 2,3biphosphoglycerate (BPG) and in situ hybridization (ISH) using Yspecific probes.Prenatal Diagn,1995,15:149-154.

　　5 GeifmanHoltzman O,Holtzman EJ,Vadnais TJ,et al.Detection of fetal HLADQα sequences in maternal blood:a genderindependent technique of fetal cell indentification.Prenatal Diagn,1995,15:261-268.

　　6 Hengstschlager M,Bernaschek G.Fetal cells in the peripheral blood of pregnant women express thymidine kinase:new marker for detection.Febs Lett,1997,404:299-302.

　　7 丁显平.现代临床分子与细胞遗传学技术.成都：四川大学出版社，2002,302.

　　8 丁显平.人类遗传与优生.北京：人民军医出版社，2005,278.

　　作者单位： 401520 重庆，合川市人民医院检验科