17β_雌二醇对子宫内膜癌细胞磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B信号传导通路的活化

17β2雌二醇对子宫内膜癌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路的活化

郭瑞霞,魏丽惠,王建六(11北京大学人民医院妇科,北京　100044)　　【摘要】　目的:探讨17β2雌二醇(E2)对子宫内膜癌细胞系HEC21A磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI23K/PKB)信号传导通路的激活作用以及PI23K抑制剂和雌激素受体(ER)拮抗剂对它的影响。方法:应用免疫印迹杂交技术检测1×1026mol/L E2作用于HEC21A细胞不同时间和不同浓度E2作用细胞15min后PKB的活化情况,同法检测PI23K抑制剂LY294002和ER拮抗剂IC I182 780对E2活化PKB的影响。结果:1×1026mo l/LE2作用于HEC21A细胞15m in时,PKB活化最明显,Ser473位点磷酸化PKB和总PKB比值(p2PKB/PKB)为017877±010346,而基础值为015198±010166(P<01001),且持续至少达2h,随着E2浓度的增加,PKB活化逐渐增强;随着LY294002作用浓度增加,E2作用HEC21A细胞后PKB的活化水平逐渐下降,浓度为50μmol/L时已完全阻断了E2对HEC21A细胞PKB的活化;而随着IC I182 780浓度的增加,E2作用HEC21A细胞后PKB的活化水平无明显改变。结论:E2可通过非转录效应,迅速激活HEC21A细胞的PI23K/PKB信号传导通路,而且是ER非依赖性的。

【关键词】　子宫内膜肿瘤;雌二醇;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路;受体,雌激素

中图分类号:R737133　文献标识码:A　文章编号:1004-7379(2005)04-0270-4

Activa tion of phospha tidylinositol 32k nia se2prote ni k nia se B(P I23K2PKB)niduced by17β2estrad iol ni endom etr ai l carc inoma cel.lGuo R u ix ia,W ei L ihu i,W ang J ian liu1D epa rt2m en t of Gynecology,People’s Hospita l,Pek ing U n iversity,B eijing 100044【Abstract】　Objective:To studywhether PI23K/PKB signaling pathway can be activatedrap idly by estradiol by non2nuclear action and also,whether P I23K inhibitor,as well as ER an2tagonist,can inhibit such non2nuclear action of E2in HEC21A.M ethods:Levels of phosphoryla2ted PKB(p 2PKB)(Ser473 site)and total PKB were exam ined by western blot in HEC21A cell af2ter stim ulation w ith 1026mol/L E2 for different tmi es and w ith varied doses of E2 for 15m in.In2hibitory effect of LY294002 and IC I182 780 on activation of PKB induced by E2 were also stud2ied.p2PKB/PKB was used as levels of activation of PKB.Results:The maxmial activation ofPKB(maxmial levels of p 2PKB/PKB)took p lace at 15m in(017877±010346,while 0m in was015198±010166,P<01001)and its activation persisted at least 2 hours after stmiulation with1026mol/L E2 in HEC21A cell.W ith increased doses of E2,the activation of PKB increasedgradually;P I23K inhibitor,LY294002,could inhibited the activation of PKB induced by E2inHEC21A.Levels of PKB decreased gradually with increased concentrations of LY294002 and50μmol/L LY294002 comp letely blocked the activation of PKB induced by E2.However,IC I182 780 did not affect the activation of PKB induced by E2.Conclusion:17β2estradiol,bynon2nuclear action,can activate p romp tly P I23K2PKB signaling pathway in endometrial carcino2ma cell line HEC21A.This action of E2is ER2independen.t

【KeyW ords】　Endometrial neoplasms;Estradiol;PI232KPKB cell signaling;Receptors,estrogen

　　无孕激素拮抗的高雌激素水平长期作用可增加子宫内膜癌的发病风险。传统认为,雌激素与受体结合后在细胞核通过“转录效应”发挥作用。研究表明[123],雌激素还具有生长因子样的“非转录效应”,与受体结合可迅速激活细胞内的信号传导通路如细胞外信号调节酶(extracellular signal2regulatedkinase,Erk)通路[1]和磷脂酰肌醇3激酶(phosphati2dylinositol 32kinase,P I23K)/蛋白激酶B(p rotein ki2nase B,PKB)通路[2,3],从而产生效应。已有研究表明,雌激素可迅速激活雌激素受体(ER)阳性子宫内膜癌细胞系Ishikawa PI23K/PKB通路[4]。本研究通过17β2雌二醇作用于ER低表达子宫内膜癌细胞系HEC21A,进一步探讨雌激素诱导HEC21A PKB的活化作用,以及PI23K特异性抑制剂对PKB活化的抑制,ER拮抗剂ICI182 780对PKB活化的影响。1　材料与方法1.1　材料来源1.1.1　细胞系　人子宫内膜癌细胞系HEC21A来源于美国ATCC细胞库,ER低表达[5]。1.1.2　试剂　水溶性的17β2E2(E2)和代血清2(SR2)购自美国Sigma公司。PI23K特异性抑制剂LY294002、总PKB多克隆抗体和抗磷酸化PKB(Ser473)多克隆抗体,辣根过氧化物酶连接的“二抗”、生物素化的蛋白分子量标准及其抗体及化学发光试剂均购自美国细胞信号传导公司。ER拮抗剂IC I182 780购自英国Tocris公司。1.2　方法1.2.1　细胞培养　HEC21A细胞置于含10%胎牛血清的DME M培养基中,于37℃、5%CO2培养箱中培养,贴壁生长。1.2.2　E2作用后细胞PKB通路活化情况的检测　用十二烷基磺酸钠聚2丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)和免疫印迹方法。(1)药物作用:以5×105个/ml接种HEC21A细胞于25cm2培养瓶中,24h后,以含1%SR2代血清的DMEM培养基继续培养至近亚铺满状态,再用1%SR22DMEM培养基换液1次,3～4h后加入药物:1026mol/L的E2作用不同时间(0、5、15、30、60、120m in)或不同浓度的E2(空白对照、1024、1026、1028、10210mol/L)作用15m in;(2)细胞总蛋白的提取、SDS2PAGE和免疫印迹杂交和再杂交蛋白条带密度扫描,测定密度,参照文献[4]进行。1.2.3　P I23K特异性抑制剂LY294002和ER拮抗剂IC I182780分别作用后E2活化PKB变化　用SDS2PAGE和免疫印迹方法,同上,仅药物处理不同。用不同浓度的LY294002(0、011、10、50、100μmol/L),不同浓度的IC I182 780(0、10211、1029、1027、1025mol/L)分别作用细胞1h;再以含上述相同浓度LY294002、ICI182 780与1026mol/L E2分别共同作用细胞15min。1.3　统计学处理　实验重复3次,结果以x±s表示,进行方差齐性检验后,行t或t检′验。2　结　果2.1　E2作用后HEC21A细胞PKB活化情况2.1.1　不同作用时间　E2可以激活HEC21A细胞PKB,1×1026mol/L E2刺激细胞不同时间显示,无雌激素刺激时,HEC21A细胞便有一定量的PKB活性,作用15min时活化最明显,磷酸化PKB(p2PKB)/PKB比值最大,2h后略有下降,见表1。2.1.2　不同作用浓度　不同浓度E2作用HEC21A细胞15min时,随浓度增加,PKB的磷酸化水平逐渐增强。见图1。2.2　P I23K抑制剂LY294002对E2活化PKB的抑制　随着LY294002浓度的增加,E2磷酸化PKB的水平逐渐下降,浓度为50μmol/L时完全阻断了E2对PKB的激活。见表2。表1　1×1026mol/L E2作用HEC21A细胞不同时间后细胞PKB的活化情况(x±s)时间(t/min)p2PKB　　PKB　　p2PKB/PKB　P0 87 493±9 017 168 090±12 965 015198±0101665 86 005±10 518 144 704±29 810 016010±010493 0105415 109 037±7 860 138 697±13 584 0.7877±010346 0.00030 89 993±533　128 091±6 868　0.7039±010389 010260 123 123±7955 163 554±13 339 0.7588±0.1125 0.022120 119 201±14 227 167 161±14 441 0.7131±010561 0.005271现代妇产科进展2005年7月第14卷第4期　ProgObstet Gynecol,July 2005,Vo.l14,No.4图1　不同浓度E2对HEC21A细胞PKB的活化　3P<0105,　3 3P<01001 vs基础状态图2　ICI182 780对E2活化HEC21A细胞PKB作用的影响表2　不同浓度的LY294002对E2活化HEC21A细胞PKB的抑制作用(x±s)LY294002浓度(cμ/mol·L21)p2 PKB PKB p2PKB/PKB P0 85 000±11 881 155 415±21 474 0.5472±0101870.1 71 269±6 862 172 640±10 526 0.4129±010330 0100410 53 708±9 427 206 941±18 912 0.2634±010698 0100250 0 171 703±47 178 0 01000100 0 218 561±15 以上结果为3次实验的平均值。以总PKB作为内参照,尤其p2PKB/PKB可一定程度上弥补各上样孔之间上样量的偏差。2.3　ER拮抗剂IC I182 780对E2活化HEC21A细胞PKB作用的影响　E2活化HEC21A细胞PKB的作用不受ICI182 780的影响,随着ICI182780药物作用浓度的增加,E2磷酸化PKB的水平无明显改变,见图2,同0mol/L相比,P>0105。

3　讨　论PKB也称为Akt,由氨基端的PH结构域、中间的激酶活性区及羧基端的尾部3部分构成,激酶活性区的苏氨酸磷酸化位点和尾部的丝氨酸磷酸化位点的磷酸化(在PKBα是Thr308和Ser473两个位点)是活化PKB所必需的。PKB活化后,可促进肿瘤细胞生长,抑制其凋亡,并可促进肿瘤血管生成[6]。本研究检测的是Ser473位点的磷酸化,以反应PKB的活化状态。雌激素对细胞增殖的调节是其作用的主要方面之一,其作用机制尚有争议,其作用机制主要涉及转录效应和非转录效应两方面。有学者[7]认为,雌激素与ER结合后,上述两种效应协同发挥作用,共同刺激细胞增殖。研究表明,在ER阳性子宫内膜癌细胞中,E2能以“非转录效应”激活PI23K/PKB信号传导通路[4],在ER阴性的子宫内膜癌细胞,是否也存在该效应,尚未见报道。3.1　E2可以“非转录效应”激活HEC21A细胞PI23K/PKB信号通路　1×1026mol/L的E2作用HEC21A细胞15 m in时,PKB有明显激活,且达高峰,经典的雌激素“转录效应”机制可以排除,因为15min时间内难以完成基因转录、翻译和蛋白修饰等。E2作用HEC21A细胞2h后p2PKB仍处于高水平。文献报道的细胞内PKB激活时间自5min～1h不等,激活持续时间有1～4h不等[8212],主要与不同刺激因子、不同的组织细胞类型有关。本研究结果显示,E2激活HEC21A细胞的最佳时间为15m in,持续至少2h以上。而且,PKB活化水平随着E2剂量的增加而逐渐升高,呈剂量依赖性的特点。与临床上高雌激素状态致内膜癌事实相符。基础状态下,HEC21A也表现出一定的PKB活性,原因是,代血清里含有少量促使细胞增殖的物质,如胰岛素也可以激活PKB[13]。3.2　P I23K抑制剂可抑制E2对HEC21A细胞PKB的活化　PH结构域与PIP3结合移向细胞质膜是PKB活化的第一步,P I23K可以使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成PIP3[6]。我们观察了不同浓度的PI23K抑制剂LY294002对E2激活HEC21A细胞PKB的抑制作用,发现随着LY294002剂量的增加,对E2活化PKB的抑制作用增强,50μmol/L时可完全抑制PKB活化。提示PI23K抑制剂有可能通过阻断P殖。LY294002还对其他多种因素,如IGF,EGF和胰岛素等对PKB的活化发挥同样的抑制作用[3,9,12,13]。在体外培养的细胞,一般25～50μmol/L的LY294002便可达到满意的抑制细胞增殖的效果。PI23K抑制剂是否可以抑制ER低表达子宫内膜癌细胞生长,有待进一步研究.E2对HEC21A细胞PKB的激活是ER非依赖性的　在ER阴性的乳癌细胞系MDA2MB2435,E2可以激活PKB,但是此作用不能被ER拮抗剂所抑制,认为是ER非依赖性的;而在ER阳性的乳癌细胞系MCF27,E2对PKB的活化是ER依赖性的,能被ER拮抗剂所抑制[14]。我们的结果表明,E2对PKB的激活不能被ER拮抗剂IC I182 780所抑制,即不依赖ER,与乳癌细胞系的研究结果一致。总之,E2可以激活HEC21A细胞的PI23K/PKB信号传导通路,而且是ER非依赖性的。参　考　文　献[1]　Zhang YJ,W ei LH,W ang JL,et al.Role of phosphatasePTEN in the activation of extracellular signal2regulatedkinases induced by estradiol in endometrial carcinomacells[J].Chin M ed J,2003,116:3832387[2]　Castoria G,M igliaccio A,B ilancio A,et al.P I32kinase inconcert with src p romotes the S2phase entry of oestradiol2stmiulated MCF27 cells[J].EMBO J,2001,20:605026059[3]　Ivanova T,M endez P,Garcia2Segura L,et al.Rap id stmiu2lation of P I23kinase/Akt signaling pathway in develop ingm idbrain neurons by oestrogen[J].J Neuroendocrinol,2002,14:73279[4]　郭瑞霞,魏丽惠,王建六,等.17β雌2二醇对子宫内膜癌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路的激活作用[J].中华妇产科杂志,2004,39:4692473[5]　郭瑞霞,王建六,赵丹,等1子宫内膜癌细胞系Ishika2wa和HEC2AI细胞雌激素受体表达[J].中国妇产科临床杂志,2005,2722274[6]　N icholson KM,Anderson NG.The p rotein kinase B/Aktsignaling pathway in human malignancy[J].Cellular Sig2nal,2002,14:3812395[7]　Levin ER.Cellular functions of p lasma membrane estrogenrecep tors[J].Steroids,2002,67:4712475[8]　Lu YL,L in YZ,LaPushin R,et a.lThe PTEN/MMAC1/TEP tumor supp ressor gene decreases cell growt h and in2duces apop tosis and anoikis in breast cancer cells[J].Oncogene,1999,18:703427045[9]　Chen R,Kim O,Yang J,et a.lRegulation of Akt/PKB ac2tivation by tyrosine phosphorylation[J].J B iol Chem,2001,276:31858231862[10]　Thomas SR,Chen K,Keaney JF.Hydrogen peroxide acti2vates endothelial N itric2oxide synthase through coordina2ted phosphorylation and dephosphorylation via a phos2phoinositide 32kinase2dependent signaling pathway[J].JB iol Chem,2002,277:601726024[11]　Boo YC,Soresu G,Boyd N,et a.lShear stress stimulatesphosphorylation of endothelial N itride2Oxide synthase atSer1179 by Akt2independent mechanism s[J].J B iolChem,2002,277:338823396[12]　Zheng WH,Kar S,Quirion R.Insulin2like growt h factor21 induced phosphorylation of the forkhead fam ily tran2scrip tion factor FKHRL1 is mediated by Akt kinase inPC12 cells[J].J B iol Chem,2000,275:39152239158[13]　A lessi DR,Andjelkovic M,Caudwell B,et a.lMe chanismof activation of PKB by insulin and IGF21[J].EMBO J,1996,15:654126551[14]　Tsai EM,W ang SC,Lee JN,et a.lAkt activation by es2trogen in estrogen recep tor2negative breast cancer cells[J].Cancer Res,2001,61:839028392