HIF-1α、VEGF、P53对老年宫颈癌浸润影响的组织芯片研究

作者:张凡,常永霞,张九鸿,姬宏

作者单位：河北北方学院附属第一医院病理科，河北 张家口 075000

    【摘要】  目的：探讨HIF-1α、VEGF、P53对老年宫颈癌局部浸润的作用。方法：应用组织芯片技术和免疫组织化学方法对比检测老年宫颈鳞状细胞原位癌30例、微小浸润癌34例、浸润癌36例中HIF-1α、VEGF、P53的表达。结果：HIF-1α在原位癌中的阳性表达率明显低于微小浸润癌、浸润癌（P<0.05和P<0.001），微小浸润癌、浸润癌中阳性表达率无明显差别(P>0.05)；VEGF在原位癌中的阳性表达率明显低于微小浸润癌和浸润癌（P<0.05和P<0.001），微小浸润癌中阳性表达率明显低于浸润癌(P<0.05)；P53在原位癌中的阳性表达率明显低于微小浸润癌和浸润癌（P<0.05和P<0.05），微小浸润癌中的阳性表达率与浸润癌无明显差别（P>0.05）。HIF-1α与VEGF阳性表达之间在微小浸润癌、浸润癌中存在密切相关（r=0.8737 P<0.01和r=0.7957 P<0.01）。HIF-1α、P53与宫颈癌的微小浸润密切相关，VEGF与宫颈癌浸润的全过程密切相关。结论：HIF-1α、VEGF、P53都与老年宫颈癌局部浸润相关，其中HIF-1α、P53在局部浸润始动阶段发挥重要作用，VEGF在浸润全过程都发挥重要作用。

【关键词】  宫颈肿瘤；免疫组织化学;基因/P53

    The Study of HIF-1α、VEGF、P53 Effection on Local Invasion

    in Old Ege Cervical Carcinoma with Tissue Microarray

    ZHANG Fan1,CHANG Yong-xia2,ZHANG Jiu-hong1,et al

    1.Department of Pathology,The First Affiliated Hospital,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China;

    2.Internal Medicine Department, Zhangjiakou Mine-Searching Equipment Hospital,Zhangjiakou,075000,Hebei,China

    【ABSTRACT】  Objective:To investigate the effection of HIF-1α、VEGF、P53 on local invasion of Cervical Carcinoma in Old age.Methods:The expressions of proteins,HIF-1α、VEGF、P53 were detected by immmunohistochemistry method and tissue microarray technology in 30 cases with carcinoma in situ、34 cases with microinvasive carcinoma and 36 cases with invasive carcinoma.Results:The expression ratio of HIF-1α in carcinoma in situ was lower than that of microinvasive carcinoma and invasive carcinoma.(P<0.05and P<0.001)There was no difference in the expression ratio of HIF-1α between microinvasive carcinoma and invasive carcinoma(P>0.05);The expression ratio of VEGF in carcinoma in situ was lower than that of microinvasive carcinoma and invasive carcinoma(P<0.05 and P<0.001)；The expression ratio of VEGF in microinvasive carcinoma was lower than that of invasive carcinoma(P<0.05);The expression ratio of P53 in carcinoma in situ was higher than that of microinvasive carcinoma (P<0.05 and P<0.05)；There was no difference in the expression ratio of P53 between microinvasive carcinoma and invasive carcinoma(P>0.05).There was positive correlation between the expresssions of HIF-1α、VEGF in invasive carcinoma and microinvisive carcinoma （r=0.8737 P<0.01 and r=0.7957 P<0.01），There was positive correlation between the expresssion of HIF-1α、P53 and microinvasion，the expresssion of VEGF and whole invisive procession.Conclution:HIF-1α、VEGF、P53 all take part in invasion of old age cervical carcinoma；HIF-1α、P53 play key role in early invasion of old age cervical carcinoma and VEGF play key role in the whole process.

【KEY WORDS】  Uterine Cervical Neoplasms;Immuno histochemistry;Genes/P53

    宫颈癌是目前危害女性健康的常见疾病，老年宫颈癌往往多局部浸润甚至远处转移才就诊，治疗效果和预后欠佳，而且其浸润转移机制尚不清楚；缺氧诱导因子在肿瘤细胞适应缺氧、能量代谢、肿瘤血管生成及增殖转移过程中发挥重要作用，同时其表达又受多种癌基因和抑癌基因的调控；缺氧诱导因子对老年宫颈癌浸润转移过程影响如何尚不清楚。本实验选取缺氧诱导因子及其相关调控因子，利用组织芯片技术在一组老年子宫颈癌患者中进行检测，希望能为老年宫颈癌浸润机制的深入研究和临床治疗提供初步依据

    1  资料与方法

    1.1  临床病理资料

    收集河北北方学院附属第一医院1998.1～2005.12月住院患者中临床病理资料齐全的子宫颈鳞状细胞原位癌30例、微小浸润性鳞状细胞癌34例、浸润性鳞状细胞癌36例，资深病理医师对切片进行复习确诊，选取典型病变区域打点后在天津肿瘤医院肿瘤研究所制作组织芯片，为防止脱片每个样本上样两个点。本组患者年龄58～69岁，平均年龄63岁。微小浸润癌定义采用第三版妇科肿瘤学会（SGO）主持设计的分期方案［1］，将微小浸润癌定义为：宫颈间质的浸润深度在3mm（含3mm）以内，没有淋巴管或血管浸润的证据，而且没有融合性舌状浸润的鳞状细胞癌。细胞分化采用Reagan等建立的分类系统［2］：大细胞非角化型癌（高分化）28例，角化型癌（中分化）49例，小细胞非角化癌（低分化）23例。原位癌和微小浸润癌中均未见淋巴结转移，浸润癌中淋巴结转移23例。肿瘤直径最大5cm，最小1.2cm；浸润癌中外生性生长25例，浸润性生长11例。

    1.2  免疫组织化学染色

    所有标本经10%甲醛常规固定,石蜡包埋,4μm连续切片。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、P53一抗试剂均购自北京中山试剂公司。主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗（采用专用微波炉进行抗原微波热修复），正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗 、三抗各1h，DAB显色10～15min，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞<10%为阴性,>10%为阳性。HIF-1α、VEGF定位在肿瘤细胞质，P53阳性表达定位在细胞核。采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取10个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性灰度单位，取其均数即为该切片的着色强度。

    1.3  统计学方法

    应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标在同一组间的表达水平以及与浸润程度之间作直线回归相关分析。以α=0.05作为具有统计学意义。

    2  结果

    HIF-1α在原位癌、微小浸润癌、浸润癌中的阳性表达率分别为56.7%(17/30)、67.8%（23/34）、69.4%（25/36），在原位癌中阳性率明显低于微小浸润癌、浸润癌（P<0.05和P<0.01）；微小浸润癌、浸润癌中HIF-1α表达率无明显差别(P>0.05)；同时我们研究显示HIF-1α在原位癌中的阳性表达细胞呈散在灶性分布，而在微小浸润癌和浸润癌中阳性细胞分布于肿瘤中心部位且多远离血管。统计学分析显示HIF-1α阳性表达水平与子宫颈癌的早期浸润（由原位癌发展为微小浸润癌）密切相关，与后期浸润（由微小浸润癌发展到浸润癌）无关。

    VEGF在原位癌、微小浸润癌、浸润癌中的阳性表达率分别为47.2%（14/30）、67.1%（22/34）、83.3%(30/36)，VEGF在原位癌中阳性表达明显低于微小浸润癌和浸润癌（P<0.05和P<0.001），微小浸润癌中阳性表达明显低于浸润癌中的表达（P<0.05）；VEGF在原位癌中低水平表达，且阳性细胞散在分布，在微小浸润癌和浸润癌的阳性细胞位于肿瘤内部并呈灶性分布，且随肿瘤发展表达水平明显增高。统计学分析显示VEGF阳性表达水平与子宫颈癌的浸润全过程密切相关。

P53在原位癌、微小浸润癌、浸润癌中的阳性表达率分别为26.6%(8/30)、41.2%（14/34）、41.6%（15/36），在原位癌中阳性表达明显低于微小浸润癌和浸润癌（P<0.05和P<0.05），微小浸润癌和浸润癌中阳性表达率无明显差别（P>0.05）；而且在浸润癌中阳性表达位于血管周围，其中4例浸润癌中存在血管内瘤栓，均为低分化癌，瘤栓细胞P53表达水平高于细胞外肿瘤细胞。统计学分析显示P53阳性表达水平与子宫颈癌的早期浸润密切相关，与后期浸润无关。

    三种指标表达水平之间两两作直线相关分析显示：HIF-1α与VEGF阳性表达之间在微小浸润癌、浸润癌中均存在密切相关（r=0.8737 P<0.01和r=0.7957 P<0.01），其它指标表达水平不存在相关。表1 HIF-1α、VEGF、P53在子宫颈癌不同阶段阳性率比较（略 ）注： χ21代表原位癌与微小浸润癌比较，χ22代表原位癌与浸润癌比较，χ23代表微小浸润癌与浸润癌比较；H代表HIF-1α，P代表P53，V代表VEGF表2  HIF-1α、VEGF、P53表达水平之间相关性分析（略 ）注： 原=原位癌，微=微小浸润癌，浸=浸润癌；r1= HIF-1α与VEGF的相关系数，r2=VEGF与P53的相关系数，r3= HIF-1α与P53的相关系数。

    3  讨论

    子宫颈癌是目前危害女性健康的常见疾病，尽管脱落细胞学检查能筛选早期子宫颈癌，但目前老年子宫颈癌早期发现仍受多种因素的困扰而延误，因此老年子宫颈癌的研究仍需关注。子宫颈癌的浸润深度不仅决定手术后的辅助治疗的选择，而且与临床预后密切相关，而肿瘤组织从原位癌进展到浸润癌的过程中必须克服组织缺氧的不利环境，诱导新生血管生成［3～5］。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)是在缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，其活性主要依靠HIF-1α实现，检测HIF-1α可动态观察组织缺氧状态，HIF-1α可调节多种靶基因如血管内皮生长因子，红细胞生成素等的表达，其活性在维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成以及促进肿瘤增殖和转移中起重要作用［6,7］。我们的实验结果显示HIF-1α在原位癌、微小浸润癌、浸润癌中的阳性表达率分别为56.7%(17/30)、67.8%（23/34）、69.4%（25/36），说明HIF-1α参与子宫颈浸润过程；原位癌中阳性率明显低于微小浸润癌、浸润癌，推测随肿瘤出现局部浸润缺氧程度加重，HIF-1α表达升高，通过与缺氧反应元件作用便利肿瘤克服缺氧并诱导新生血管形成，浸润生长；微小浸润癌、浸润癌中HIF-1α表达率无明显差别，推测随肿瘤浸润深度增加，新生血管密度增加，缓解了组织缺氧；同时我们研究显示HIF-1α在原位癌中的阳性表达细胞呈散在灶性分布，而在微小浸润癌和浸润癌中阳性细胞分布于肿瘤中心部位且多远离血管，连续切片对比染色结果显示HIF-1α高表达区域VEGF也高表达，统计学分析显示两者在微小浸润癌和浸润癌中表达之间存在密切相关，这提示HIF-1α及其下游基因VEGF蛋白表达通过诱导新生血管形成在这组老年子宫颈癌浸润过程中发挥重要作用；统计学分析还显示HIF-1α阳性表达水平与子宫颈癌的早期浸润密切相关，与后期浸润无关，说明HIF-1α出现高表达是子宫颈癌浸润的早期事件，而在后期浸润中发挥次要作用。

    VEGF作为可溶性的血管形成因子，在促进肿瘤血管形成中起重要作用，是目前发现的作用最强的促血管生成因子，主要机制为1）：VEGF诱导内皮细胞表达整合素-1及其配体，介导内皮细胞浸润和转移［8］。2）：VEGF诱导内皮细胞分泌多种组织蛋白酶及其组织因子，降解细胞外基质，介导内皮细胞迁移，诱导新生血管生成［9］。新近研究认为VEGF导致血管通透性增加进而导致血浆蛋白外渗便利肿瘤细胞从细胞外间质中直接获得营养，在横纹肌肉瘤中对内皮细胞增殖和间质塑形中发挥重要作用［10,11］。本实验中VEGF在原位癌、微小浸润癌、浸润癌中的阳性表达率分别为47.2%（14/30）、67.1%（22/34）、83.3%(30/36)，统计学分析显示原位癌中阳性表达明显低于微小浸润癌和浸润癌中的阳性表达率（P<0.05和P<0.001），微小浸润癌中阳性表达明显低于浸润癌中的表达（P<0.05），推测随肿瘤浸润过程缺氧加重，诱导HIF-1α高表达，位于其下游的VEGF基因同时出现高表达，不仅新生血管密度增加便利肿瘤细胞获得营养，而且VEGF诱导分泌的多种组织蛋白酶及其组织因子使肿瘤细胞容易在细胞外基质中迁移；VEGF在原位癌中低水平表达，且阳性细胞散在分布，在微小浸润癌和浸润癌的阳性细胞位于肿瘤内部并呈灶性分布，且随肿瘤发展表达水平明显增高。统计学分析显示VEGF阳性表达水平与子宫颈癌的浸润全过程密切相关，因此可以认为VEGF在老年子宫颈癌的浸润中发挥重要作用。

P53基因是一种抑癌基因，其野生型蛋白在G1期可监视DNA损伤，促使损伤DNA修复，若不能修复则引发细胞凋亡，突变型P53或与DNA肿瘤病毒编码的蛋白结合均可导致P53功能失活。野生型P53蛋白诱导HIF-1α亚基泛化,抑制HIF-1活性,同时可诱导产生血管生成抑制因子血小板反应素,野生型p53缺失可促进HIF-1α、VEGF积聚［12～14］,因此突变型P53高表达或野生型P53表达缺失对肿瘤组织内血管化具有重要作用。我们研究肿瘤组织中检测到突变型P53表达，在原位癌、微小浸润癌、浸润癌中的阳性表达率分别为26.6%(8/30)、41.2%（14/34）、41.6%（15/36），在原位癌中阳性表达明显低于微小浸润癌和浸润癌中的阳性表达率（P<0.05和P<0.05），微小浸润癌和浸润癌中阳性表达率无明显差别（P>0.05）,子宫颈癌肿瘤细胞P53基因突变对肿瘤局部浸润产生重要作用，统计学分析显示P53阳性表达水平与子宫颈癌的早期浸润密切相关，与后期浸润无关，因此认为P53突变后监视功能的丧失以及对肿瘤组织血管化的作用使正常细胞恶变并获得浸润特性；同时浸润癌中4例存在血管内瘤栓，均为低分化癌，瘤栓细胞P53表达水平高于细胞外肿瘤细胞，肿瘤P53表型改变是否与血道转移相关尚需大样本深入研究。

    三种指标表达水平之间两两作直线相关分析显示：HIF-1α与VEGF阳性表达之间在微小浸润癌、浸润癌中均存在密切相关（r=0.8737 P<0.01和r=0.7957 P<0.01），其它指标表达水平不存在相关。说明HIF-1α与VEGF协同作用与该研究组样本的浸润密切相关；而突变型P53表达与HIF-1α和VEGF的表达之间未发现相关，可能与HIF-1α同时受多种因素调节，P53发挥次要作用有关。

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