榄香烯联合三苯氧胺对乳腺癌MCF

作者:周小娟,郑棋,赵小丽,马海 

【关键词】  乳腺癌；三苯氧胺；榄香烯；协同作用

　　摘要： 目的  观察榄香烯和三苯氧胺对乳腺癌细胞的抑制效应，尤其是两者联合应用有无协同增效作用。方法  将MCF7细胞培养于RPMI1640培养基中，置入37℃，100%湿度，5%(体积分数)的CO2培养箱内。接种细胞并加入实验药物，用CCK8法检测三苯氧胺联合榄香烯对细胞的增殖抑制效应，用酶标仪在450nm测量每孔吸光度值，计算每组细胞抑制率。结果  无毒剂量的榄香烯与治疗剂量的三苯氧胺联合应用，吸光度均值较单用三苯氧胺明显下降，并且相应的细胞抑制效应较单用组明显上升。结论  无毒剂量的榄香烯能够使三苯氧胺对乳腺癌细胞的抑制效应显著增强，提示榄香烯与三苯氧胺联合应用具有协同作用。

　　关键词：乳腺癌；三苯氧胺；榄香烯；协同作用

　　The inhibitory effect of elemene combined with tamoxifen　on the breast cancer MCF7 cell line

　　Zhou Xiaojuan, Zheng Qi, Zhao Xiaoli, Ma Hailin

　　(Department of Oncology, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective  To explore if elemene can synergize tamoxifen through using noncytotoxic dose of elemene and tamoxifen in combination on MCF7cell line of breast cancer. Methods  First, MCF7 cell line was cultured in RPMI1640. Then, TAMs inhibitory effect united with elemene on MCF7 cell line was analyzed by using CCK8 test. Results  When adding noncytotoxic dose of elemene and curative dose of tamoxifen into the two experimental groups, the absorptivity in the two groups reduced notably, compared with that of the groups using tamoxifen alone; accordingly, the inhibition rate in two mixing groups increased obviously compared with that in singledrug groups. Conclusion  Elemene of innocuous dose can remarkably enhance the inhibitory effect of tamoxifen, which indicates that elemene may synergize the effect of tamoxifen on breast cancer.

　　KEY WORDS:breast cancer; tamoxifen; elemene; synergistic effect

　　乳腺癌是妇女中最常见的恶性肿瘤。它是一种全身性疾病，全身辅助治疗可降低复发和死亡的风险[1]。乳腺癌内分泌治疗作为全身治疗的方法之一，在乳腺癌术后预防复发及转移后的治疗具有十分重要的作用[2] 。三苯氧胺(tamoxifen, TAM)作为内分泌治疗一线药物已经广泛应用于乳腺癌高危妇女的预防性治疗[3]以及乳腺癌雌激素受体阳性(ER+)患者的辅助内分泌治疗[4]。然而同类抗雌激素药物对于TAM治疗失败者却效果甚微；第3代芳香化酶抑制剂作为绝经后TAM治疗失败后的二线药物，虽具有高效、选择性、毒副作用少等特点，但仅对绝经后患者有效，且价格较TAM高。TAM作为乳腺癌患者内分泌治疗的首选药物，长期应用有可能增加子宫内膜癌的危险性[56]。还会产生继发耐药或肿瘤的复发和转移，均影响其临床疗效。本研究采用中药莪术提取物榄香烯(elemene, ELE)和TAM联合应用于乳腺癌MCF7细胞系，探索ELE对TAM有无协同增效作用，从而为ELE参与乳腺癌的辅助治疗，提高内分泌药物的疗效开辟新的思路。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂  乳腺癌MCF7细胞株，由西安交通大学医学院病理学系提供；RPMI1640培养基和胰蛋白酶，购自美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自(中国)鼎国公司；胰岛素、EDTA和三苯氧胺(TAM)系美国Sigma公司产品；CCK8试剂由同仁化学研究所中国(上海)代办处提供；榄香烯(ELE)4℃冰箱保存，系中国大连金港制药有限公司产品。

1.2  常用工作液的配制  ①磷酸缓冲液(PBS)的配制：称取KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g， Na2HPO4?12H2O 2.89g，混合溶解于1000mL的双蒸水中，并调定pH 7.2-7.4。② 消化液的配制：胰蛋白酶粉末0.25g，EDTA 0.04g，加入PBS 液100mL并用磁力搅拌器使其完全溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，于-20℃保存。

　　1.3  细胞培养  将MCF7细胞培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃，100%湿度，5%(体积分数)的CO2培养箱内。

　　1.4  CCK8法检测三苯氧胺联合榄香烯对细胞增殖的抑制效应  将细胞接种于96孔培养板，培养24h。以8孔为一组分别加入4个不同浓度的TAM(T2-T5，即1.50×10-5、1.50×10-6、1.50×10-7、1.50×10-8mol/L)和4个不同浓度的ELE( E1-E4，即6.15×10-1、6.15×10-2 、6.15×10-3、6.15×10-4g/L)溶液，最后加入2种不同浓度的混合液，在培养箱内培养48h。然后每孔加入10μL CCK8液，培养4h，用酶标仪在450nm测量每孔吸光度值，计算每组细胞抑制率。

　　1.5  数据分析  用SPSS 11.5统计分析软件进行方差分析，采用LSD及Dunnett法两两比较进行描述性统计，方差齐性检验和绘制均数分布图(α ：0.01)。

　　2  结果

　　2.1  TAM、ELE不同浓度组平均吸光度的变化规律  随着TAM的浓度由T2组-T5组(1.50×10-5、1.50×10-6、1.50×10-7、1.50×10-8mol/L)逐渐降低，平均A值逐渐升高；随着ELE的浓度由E1组-E4组(6.15×10-1、6.15×10-2 、6.15×10-3、6.15×10-4g/L)逐渐降低，平均A值逐渐升高，将无毒剂量(6.15×103 g/L)的ELE与中等有效剂量的TAM合用后，两联合用药组(T3E3组与T4E3组)的平均A值均较单用药组(T3、T4和E3组)的平均A值明显下降(图1)。    　　随着TAM的浓度由T2组-T5组逐渐降低，平均抑制率[存活率(%)=用药组吸光度/对照组吸光度×100%；抑制率(%)=1-存活率]逐渐下降；随着ELE的浓度由E1组-E4组逐渐降低，相应各组细胞的平均抑制率则逐渐下降。由此可见TAM和ELE对MCF7细胞的抑制效应均具有剂量依赖性，其平均抑制率分别与其浓度呈正相关(图2)。

　　图1  各组吸光度均数分布图(CCK8)（略）

　　Fig.1 The scatter gram of each group s mean absorptivity by CCK8 method

　　T: TAM(mol/L); T2: 1.5×10-5; T3: 1.5×10-6; T4: 1.5×10-7; T5: 1.5×10-8; E: ELE (g/L); E1: 6.15×10-1; E2: 6.15×10-2; E3: 6.15×10-3; E4: 6.15×10-4

　　图2  TAM与ELE作用下各加药组细胞抑制率的变化曲线（略）

　　Fig.2 The changes of inhibition rate with different concentration of TAM and ELE

　　T: TAM(mol/L); T2: 1.5×10-5; T3: 1.5×10-6; T4: 1.5×10-7; T5: 1.5×10-8; E: ELE (g/L); E1: 6.15×10-1; E2: 6.15×10-2; E3: 6.15×10-3; E4: 6.15×10-4

　　2.2  TAM、ELE不同浓度组吸光度变化的比较  结果见表1。

　　表1  各组间A值均数的差异性的比较（略）

　　Table 1  Comparison of the variability among the A means in all groups

　　a: P<0.01, compared with control; b: P<0.01, T3-T4E3 vs. T2; c: P<0.01, T4-T4E3  vs. T3; d: P<0.01, T5-T4E3  vs. T4; e: P<0.01, E1-T4E3  vs. T5; f: P<0.01, E2-T4E3  vs. E1; g: P<0.01, E3-T4E3  vs. E2; h: P<0.01, E4-T4E3  vs. E3; i: P<0.01, T3E3, T4E3 vs. E4; j: P<0.01, T4E3 vs. T3E3

　　2.3  各组细胞抑制率的变化规律  当TAM的浓度从T2-T5下降时，实验组细胞抑制率逐渐下降(P<0.01，图3)；当ELE的浓度由E1-E4降低时，实验组细胞抑制率逐渐下降(P<0.01，图4)；E3浓度的ELE与T3浓度的TAM 合用(T3E3)后细胞抑制率较单用T3的细胞抑制率明显上升，也明显高于T3的细胞抑制率与E3的抑制率之和(P<0.01，图5)；E3浓度的ELE 与T4浓度的TAM合用(T4E3)后细胞抑制率较单用TAM的T4组细胞抑制率明显上升，也明显高于T4的细胞抑制率与E3的抑制率之和(P<0.01，图6)。

图3  不同浓度的TAM作用下各加药组细胞抑制率的变化（略）

　　Fig.3 The inhibition rate changes in the experimental groups of different concentrations of TAM

　　图4  不同浓度的ELE作用下各加药组细胞抑制率的变化（略）

　　Fig.4 The inhibition rate changes in the experimental groups of different concentrations of ELE

　　图5  T3浓度的TAM与E3浓度的ELE合用前后细胞抑制率的变化（略） 　　Fig.5 The inhibition rate changes with the concentrations of T3 and E3

　　图6  T4浓度的TAM与E3浓度的ELE合用前后细胞抑制率的变化（略）

　　Fig.6 The inhibition rate changes with the concentrations of T4 and E3

　　3  讨论

　　3.1  三苯氧胺对MCF7细胞的抑制效应  本研究表明，TAM对乳腺癌MCF7细胞株的抑制作用具有剂量依赖性。当TAM的浓度由1.50×10-5mol/L降至1.50×10-8mol/L(T2-T5)时，细胞抑制率由40.67%降至6.71%(CCK8法)。TAM对MCF7细胞的抑制作用由开始的明显逐渐降至基本丧失抑制作用。提示TAM的抑制效应与其作用浓度呈正相关性。经统计分析，T5组与对照组之间的吸光度均值无显著性差异。说明T5浓度时TAM对MCF7细胞已经丧失抑制作用，而T2、T3、T4浓度是TAM的有效抑制浓度，其对应组细胞吸光度均值与对照组有显著性差异(P<0.01)。理论上讲，TAM的浓度越高，对乳腺癌细胞的抑制作用越强，具有明显的剂量相关性。但是，临床使用的TAM在避免加重其毒副作用的前提下的标准口服剂量(20mg/d)只相当于体外培养中所加TAM的中等浓度，即1.50×10-6mol/L。此浓度下TAM对MCF7细胞仅具有30%左右的抑制率。因而，如果能够提高同样浓度下TAM的抗癌活性，则对提高临床疗效具有一定参考价值。

　　3.2  榄香烯对MCF7细胞的抑制效应  结果表明，ELE对乳腺癌细胞MCF7的抑制效应也具有剂量依赖性。在E1-E4(6.15×10-1、6.15×10-2 、6.15×10-3、6.15×10-4g/L)四个不同浓度ELE作用下，乳腺癌细胞受到的抑制作用逐渐减弱，抑制率由33.22%降至3.76%(CCK8法)。提示ELE的抗肿瘤作用与其浓度呈正相关性。统计分析表明，当ELE的浓度下降至E3(6.15×10-3g/L)时，ELE对MCF7细胞的抑制效应基本消失，E3组与E4组吸光度均值与对照组之间无显著性差异。说明E3浓度为ELE的临界无毒剂量。而E1、E2浓度为ELE对乳腺癌细胞的有效抑制剂量，其对应组细胞吸光度均值与对照组有显著性差异(P<0.01)。由于ELE本身对乳腺癌细胞具有抑制作用，因此本实验为了研究ELE对TAM是否具有抑制效应，必须选择无毒剂量的ELE与有效剂量的TAM合用，以排除ELE本身的抗瘤作用带来的偏倚。本实验选用ELE的临界无毒剂量E3与TAM的有效浓度T3、T4联合应用。

　　3.3  榄香烯对三苯氧胺的协同增效作用  ELE除了具有直接的抗肿瘤作用外，还有对放疗增敏[7]、减轻化疗副作用、协同增效和逆转化疗药物耐药的作用。本实验将ELE与TAM联合应用正是为了探讨ELE在乳腺癌内分泌治疗中的作用。文献报道[8]及实验证明的对MCF7细胞株无毒剂量(E3：6.15×10-3g/L)的ELE，与实验中常用的TAM浓度T3和T4(1.50×10-6，1.50×10-7mol/L)联合应用于MCF7细胞。结果发现，无毒剂量的ELE能够显著提高TAM对乳腺癌MCF7细胞的抑制率；CCK8法检测联合用药，T3E3组、T4E3组的细胞抑制率分别较T3、T4组提高了14.24%和14.15%。统计分析表明，T3E3组吸光度均值与T2组之间无显著性差异，与T3组间有显著性差异；T4E3组吸光度均值与E1组间无显著性差异，与T4组间有显著性差异。CCK8法结果提示，T3浓度的TAM对细胞的抑制效果经E3浓度的ELE作用后与T2浓度的TAM无显著性差异，抑制效果相当；而T4浓度的TAM对细胞的抑制效果经E3浓度的ELE作用后与E1组的ELE无显著性差异，抑制效果相当(原先的T4组吸光度均值与E1组有显著性差异，抑制效果小于E1组)。由此可见，经过无毒剂量的ELE作用后，治疗浓度的TAM对MCF7细胞的抑制效应得到明显增强。综上所述，ELE作为一种植物抗癌药对乳腺癌不但具有明显的抑制作用，而且由于ELE与TAM的抗乳腺癌的机制的差异，二者的联合应用可能会使它们的抗肿瘤作用增强。

参考文献：

　　[1]Kelleher M, Miles D. The adjuvant treatment of breast cancer [J]. Int J Clin Pract, 2003, 57(3):195199.

　　[2]艾斌,石远凯. 乳腺癌内分泌治疗的历史与现状 [J].中国实用外科杂志, 2003, 23(10):6264.

　　[3]Tormey DC, Gray R, Falkson HC. Postchemotherapy adjuvant tamoxifen therapy beyond five years in patients with lymph nodepositive breast cancer [J]. J Natl Cancer Inst, 1996, 88(24):18281833.

　　[4]谢铭,曾庆良. 可手术乳腺癌三苯氧胺辅助内分泌治疗的临床观察 [J]. 中国医师杂志,  2005, 7(8):1067.

　　[5]张培宇, 张代钊. 三苯氧胺治疗乳腺癌的相关副作用及其评价 [J]. 中国肿瘤临床与康复, 2004, 11(3):271273.

　　[6]朱燕.三苯氧胺治疗后发生子宫内膜病变2例报告 [J]. 西安医科大学学报, 1998,19(2):281.

　　[7]程伟,乔哲,石涛,等. β榄香烯对肾癌细胞的体外放射增敏作用 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2004, 25(2):183185.

　　[8]胡军，赵瑾瑶，杨佩满. β榄香烯乳剂逆转多药耐药细胞株MCF7/ADM对阿霉素耐药性研究 [J]. 中国微生态学杂志, 2002,14(4):214215.

　　基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(No.20021210G3(05))

　　(西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤内科，陕西西安  710061)