乳腺癌组织中MMP9、P53的表达和微血管密度的检测及其意义

作者:吴雪兰,温达雄

作者单位：1.广东省河源市卫生学校，广东河源 517300；2.广东省河源市人民医院，广东河源 517000

    【摘要】  目 的 观察乳腺癌细胞中MMP9、P53的表达及组织中微血管密度与患者腋淋巴结及远处肿瘤转移之间的关系，以探讨它们与乳腺癌生物学行为的关系及机制。方法 通过组织化学方法检测MMP9、P53在肿瘤细胞中的表达，在显微镜下计算肿瘤组织中微血管密度值，观察其与患者腋淋巴结及远处肿瘤转移之间的关系。结果 MMP9主要分布在胞浆，20例乳腺纤维腺瘤细胞均未表达MMP9，乳腺癌细胞内随同侧腋淋巴结转移量的增多，MMP9阳性级别增加(P<0.01)；P53主要表现为核阳性，20例乳腺纤维腺瘤细胞中18例未表达 P53，随同侧腋淋巴结转移量的增多，P53表达级别增加(P<0.01)；随同侧腋淋巴结转移量的增多, 微血管密度明显增加（P<0.01）。结论 肿瘤细胞中MMP9、P53蛋白的高表达及MVD值可以作为评估患者腋淋巴结转移及其它部位远处转移的重要指标。

【关键词】  P53蛋白 MMP9 微血管密度 乳腺癌 肿瘤转移

　　乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，腋淋巴结及远处肿瘤转移是造成患者复发及死亡的主要原因。本研究观察乳腺癌细胞中基质金属蛋白酶9 (MMP9)、P53蛋白的表达、乳腺癌组织中微血管密度(MVD)与患者腋淋巴结及远处肿瘤转移之间的关系，以探讨它们与乳腺癌生物学行为的关系及可能的机制，为临床开展新的治疗方案做好的一定的基础研究。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    选择1998至2007年病理诊断为进展期乳腺恶性肿瘤的手术标本63例，病例随访资料完整。根据淋巴结转移情况将其分为3组：无同侧腋淋巴结转移者23例为I组，有6个以内（含6个）同侧腋淋巴结转移者21例为Ⅱ组，有6个及以上同侧腋淋巴结转移或远处转移者l9例为Ⅲ组；同时将乳腺纤维腺瘤20例作为对照组。检察以上患者组织中MVD、P53及MMP9的表达，并分析以上指标的改变与淋巴结转移及远处转移者之间的关系。

    1.2  方法

    乳腺病变组织微血管的计算［1］：首先低倍镜下扫视整个组织切片以CD34阳性作为内皮细胞标记，找到内皮细胞染色清晰，背景对照良好，微血管数量最密集的部位，以染成棕黄色单个细胞或内皮细胞丛做为一个血管计算，然后在×200视野范围任选不重复的3个视野，计数每个视野的血管数，以其平均值作为MVD。凡管腔大于8个红细胞、炎症、肉芽、坏死区和带有较厚肌层的血管均不计入总数。

    MMP9、P53表达检测：采用酶标记链亲和素生物素法，一抗使用鼠抗人MMP9、P53单克隆抗体，二抗使用生物素化的羊抗鼠单克隆抗体，三抗使用链亲和素酶标记物，采用DAB法显色，空白对照由PBS代替一抗制得。阳性对照分别为已知MMP2 、P53阳性的乳腺癌切片。在细胞胞浆中出现棕黄色颗粒即为阳性细胞，按整张切片中肿瘤细胞阳性表达占总的肿瘤细胞数的百分比得出半定量分值：无细胞染色为-、染色细胞<5％+、5～20％、21～50％、>50％。

    1.3  统计处理

    数据以均数±标准差（±s）表示。采用GraphPad Prism 4.0软件包行统计学处理，组间均数比较采用方差分析及q检验，有序分类资料的比较采用秩和检验。

    2  结果

    2.1  MMP9的表达

    乳腺癌细胞内出现大小不等的棕黄色颗粒，表达数量不等，主要分布在胞浆，以位于靠近基底膜方向的胞浆分布较为密集。20例乳腺纤维腺瘤细胞均未表达MMP9。随同侧腋淋巴结转移量的增多，MMP9阳性级别增加(P<0.01)，见表1。表1  不同组别中MMP9表达与腋淋巴结转移的关系（略）

2.2  P53的表达

    乳腺癌细胞内出现P53表达，其数量不等，主要表现为核阳性。20例乳腺纤维腺瘤细胞中18例未表达P53。随同侧腋淋巴结转移量的增多，P53表达级别增加(P<0.01)，见表2。表2  不同组别中P53表达与腋淋巴结转移的关系（略）

    2.3  MVD与腋淋巴结转移的关系

    随同侧腋淋巴结转移量的增多, MVD明显增加，组间两两比较均差异有统计学意义（P<0.01），见表3。表3  不同组别MVD情况（略）

　　3  讨论

    基质金属蛋白酶是一组Zn依赖性内肽酶，主要由肿瘤细胞合成和分泌，在降解细胞外基质及基底膜的作用的同时增强肿瘤血管的生成作用，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。MMP9是MMPs中相对分子质量最大的酶，以胶原的形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，可以降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质中的Ⅳ型、V型胶原和明胶［2］，促进肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，最终导致肿瘤的侵袭和转移，所以MMPs与肿瘤的侵袭、转移能力和患者生存率密切相关［3］。本研究发现本组病例中良性病变的细胞均未表达MMP9，而乳腺癌细胞内表达MMP9，并且随患者同侧腋淋巴结转移数量的增多，MMP9阳性级别增加(P<0.01)，两者有密切关系。MMP9在伴淋巴转移的乳腺癌中的表达比不伴有淋巴转移的病例明显升高，这说明MMP9与乳腺癌组织的基质浸润及淋巴结转移密切相关［4］。

    大量的研究表明血管生成在原发肿瘤的生长与侵袭中至关重要［5］，肿瘤向外浸润生长过程中，血管生成是同步进行的。当实体瘤体积达3 mm后，生长必须依赖新生血管形成。肿瘤性新生血管结构异常、排列紊乱、基底膜不完整，癌细胞可经内皮细胞间隙、血管幼芽开放末端等途径造成乳腺癌的淋巴转移和远处转移。所以本研究使用MVD作为观察乳腺癌远处转移的重要指标。本研究结果显示，随同侧腋淋巴结转移量的增多, MVD明显增加（P<0.01）。研究同时发现，MMP9高表达组与MVD高组重合，即在良性乳腺肿瘤患者中两者表达均为阴性，而随患者同侧腋淋巴结转移数量的增多，MMP9阳性级别增加，MVD增加(P<0.01）。

    p53是一种涉及细胞周期调节和细胞凋亡的蛋白，是肿瘤中最常见的突变基因之一，野生型为抑癌基因，突变型有致癌活性。有研究认为，突变型p53蛋白可能通过诱导iNOS和VEGF表达促进肿瘤血管形成，从而参与肿瘤的演进［6］。本研究表明，p53在乳腺癌细胞中阳性表达率明显高于良性乳腺肿瘤细胞，随同侧腋淋巴结转移量的增多，p53表达级别也增加 (P<0.01)。而且本研究进一步发现MVD、MMP9随p53表达增强而增高，提示p53与肿瘤血管形成及肿瘤转移密切相关。其原因可能为p53突变使细胞在缺氧条件下存活，而且通过增加VEGF等血管生成因子分泌启动血管生成。另有研究认为p53突变可以上调MMP9基因的转录，进而影响其蛋白表达。所以通过本研究我们认为肿瘤细胞中MMP9、p53蛋白的高表达及MVD值可以作为评估患者腋淋巴结转移及其它部位远处转移的重要指标。

【参考文献】  　　［1］王辅林,韦立新,陈乐真. 血管内皮生长因子、MVD与乳腺癌淋巴结转移及预后的关系［J］.中华病理学杂志, 2000,29(3):172175.

　　［2］YU Q, STAMEN R L. Localization of matrix matalloproteinase 9 to the ceil surface provides a mechanism for CD44mediated tumor invasion［J］. Genes Dev,1999，13(1)：3548.

　　［3］NAKOPOULOU L,TSIRMPA I，ALEXANDROU P, et a1. MMP2 protein in invasive breast cancer and the impact of MMP2/TIMP2 phenotype on overall surviva1［J］.Breast Cancer Res Treat, 2003,77(2):145155.

［4］李治,帅晓明,黄韬. MMP2、MMP9在乳腺癌转移中作用的研究［J］.华西医学, 2006,21(1)：4344.

　　［5］BROWN L F,BERSE B,JACKMAN R W,et a1.Expression of vascular permeability factor(vascular endothelial growth factor)and its receptors in breast cancer ［J］. Human Pathol，1995，26(1)：86.

　　［6］BOSSI P, BRICAIRE F. Botulism toxin.bioterrorist weapon［J］. Presse Med，2003，32(10)：463465.