不同促排卵方案患者宫颈黏液中TNFα与卵泡发育、排卵的相关性

作者:吕淑兰,张巧利,曹缵孙作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安 710061

  【摘要】  目的 探讨不同促排卵方案患者宫颈黏液(CM)中肿瘤坏死因子α(TNFα)水平与卵泡发育及排卵的相关性。方法 选择2004年2月至2005年1月在本院生殖内分泌研究室就诊的36例不孕妇女为研究对象，15名正常月经妇女为对照研究对象。共分三组，分别为克罗米酚组、尿促性素(HMG)和超促排卵(COH)组。于月经周期早卵泡期、围排卵期及黄体高峰期收集CM及血清，采用双抗RIA测定TNFα水平及FSH、LH、E2、P水平，同时行阴道B型超声监测卵泡发育、子宫内膜厚度及排卵情况。结果 ①CM中TNFα在正常月经周期及促排卵周期中存在周期性变化，卵泡期开始上升，围排卵期达高峰，进入黄体期后下降，其中围排卵期CM中TNFα水平最高，差异有显著性(P<0.05)；②CM中TNFα与卵泡大小呈正相关(r=0.261, P<0.05)，与子宫内膜厚度呈正相关(r=0.183, P<0.05)，与CM评分无明显相关性；③排卵组与未排卵组CM中TNFα比较，显示排卵组TNFα水平明显高于未排卵组，差异有显著性(P<0.05)。结论 CM中TNFα在正常月经周期及促排卵周期中存在周期性变化，排卵期达高峰，有望作为预测排卵的另一指标；TNFα在卵泡发育及排卵过程中起重要作用。

【关键词】  促排卵；宫颈黏液；TNFα；卵泡发育；排卵

　　The correlation between TNFα level in cervical mucous for the differentialprotocols of ovulation stimulation and follicle development and ovulationLü

　　Shulan, Zhang Qiaoli, Cao Zansun, Wang Li, Sun Ting

　　Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the level of TNFα in cervical mucous when applying variable protocols of ovulation stimulation, and the possible correlation with either follicle development or ovulation. Methods  Totally 36 patients with infertility treated in the Reproductive and Endocrinology Research Center of our hospital were observed in this study, and 15 women with normal menstruation and conception were taken as control. The patients were divided into three subgroups according to the ovulation stimulating protocol they received, clomiphene, HMG and COH subgroup. We collected cervical mucous and serum, respectively during early follicular phase, periovulation phase, and mature luteal phase, and tested TNFα, FSH, LH, E2, and P level of both mucous and serum using double radioimmunoassay. Simultaneously, the condition of follicle development, thickness of endometrium and ovulation were monitored by transvaginal ultrasonography. Results  ① TNFα of cervical mucous appeared periodical changes along the menstrual and ovulating cycle: ascending in follicular phase, reaching the platform in ovulation phase and declining as stepping into luteal phase, and peak titer of periovulation period was statistically correlated (P<0.05). ② TNFα in cervical mucous showd positive correlation with the size of follicle (r=0.261, P<0.05), either with the thickness of endometrium (r=0.183, P<0.05), but no obvious relationship with the score of mucous. ③ Compared with unovulation group, TNFα level was significantly higher than ovulation group, and statistically meaningful (P<0.05). Conclusion  Periodical variation and ovulation phase peak level of TNFα in cervical mucous might make it a potential marker applied for forecasting ovulation. TNFα might play a key role in the process of follicle development and ovulation.

KEY WORDS: ovulation stimulation; cervical mucous; TNFα; follicle development; ovulation

　　近年来，在世界范围内不孕症的发病率逐年升高，而其中25%-30%的原因为排卵障碍[1]。促排卵治疗及监测卵泡的发育、排卵成为该群体治疗的核心内容。宫颈黏液(cervical mucous, CM)中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα)与卵泡发育及排卵的关系也是研究的热点。TNFα是一种多功能的细胞因子，除抗肿瘤作用外，还介导炎症及免疫反应[1]，并对生殖的多个环节产生作用。本文以我院不孕患者为研究对象，对不同的促排卵方案患者CM中TNFα水平、血清性激素水平进行测定。同时，阴道B超监测卵泡发育、子宫内膜厚度及排卵状况。探讨不同促排卵方案患者CM中TNFα水平变化与卵泡发育、排卵的关系，为临床促排卵方案的选择提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象

　　收集2004年2月至2005年1月在本院生殖内分泌室就诊的36例不孕妇女为研究对象，其中使用克罗米酚(clomiphene Citrate, CC)促排卵12例，主要为无排卵或稀发排卵的不孕者；12例尿促性素(human menopause gonadotropin, HMG)促排卵主要针对下丘脑、垂体功能低下的不孕者；12例超促排卵(controlled ovary hyperstimulation, COH)主要用于女性因输卵管梗阻而行体外受精胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVFET)的不孕患者，方法为GnRHa+HMG+HCG。选取同期在我院就诊的23-35岁月经正常妇女15例为对照组。

　　1.2  方法

　　1.2.1  血清的采集与分离

　　所有研究对象均于月经周期第2-4天(早卵泡期)，月经第12-14天(围排卵期)及第19-21天(黄体期)晨9-11点采集空腹肘静脉血5mL，3000r/min离心分离血清20min，-40℃保存。采用RIA测定血清FSH、LH、E2、P。

　　1.2.2  CM的采集

　　分别于月经第2-4天(早卵泡期)、月经第12-14天(围排卵期)及第19-21天(黄体期)采集CM。用窥器暴露宫颈，灭菌干棉球拭净宫颈表面分泌物，用1mL注射器从宫颈内口处尽量吸净黏液，置于Ependoff管中，放入-40℃冰箱保存。检测前先行冻融，称重后加入1mL生理盐水在-4℃条件下用超声波粉碎机液化。然后，以3000r/min离心20min，取上清液置入-40℃冰箱保存待测。采用双抗RIA测定TNFα。

　　1.2.3  监测卵泡及子宫内膜

　　使用EUB500型日立阴道B超监测卵泡发育。正常对照组及CC促排卵组从月经周期第8天开始监测卵泡发育(CC Mc5-9，口服50-100mg/d×5d)；HMG组(Mc 2d始，肌肉注射HMG 2-3支/d)；IVFET(阿拉瑞林150μg皮下注射，每日一次，Mc 21d至注射HCG日；FSH 2-4支皮下注射，每日一次，Mc 3d至注射HCG日)组于月经周期第8天监测卵泡发育。三组均监测有2个卵泡平均直径≥18mm时，肌注HCG 6000-10000iu，IVFET组36h后取卵，其余均需监测卵泡破裂情况、时间，并记录。

　　1.2.4  子宫内膜厚度的测定

　　纵切显示子宫内膜，距宫底1cm处测量前后子宫肌层与内膜交界面的距离，即自一侧子宫内膜强回声线与声晕交界至另一侧子宫内膜强回声与声晕交界处为子宫内膜厚度。

　　1.2.5  排卵征象的判断[2]  　　①卵巢卵泡消失；②卵泡直径缩小；③卵泡形态改变，边缘出血、皱折或不光滑；④或伴有Douglas腔液性暗区。

　　1.3  统计学处理

　　计量资料数据以均数加减标准差(±s)表示，数据分析采用SPSS11.5统计分析软件，统计学方法为重复测量方差分析及相关性分析，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2  结 果

　　2.1  妇女生殖周期中CM TNFα水平的变化

　　在围排卵期，TNFα水平最高，各期相比差异有统计学意义(P<0.05)。研究各组与对照组相比，其中COH组的TNFα最高，HMG组次之，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。表1  宫颈黏液中TNFα在生殖周期中的比较（略）

2.2  TNFα与卵泡大小、子宫内膜厚度及宫颈黏液评分的相关分析

　　CM中TNFα与卵泡大小呈正相关(r=0.261, P<0.05)、与子宫内膜厚度呈正相关(r=0.183, P<0.05)、与宫颈黏液评分无明显相关性(P>0.05)。

　　2.3  排卵组与未排卵组CM中TNFα水平的比较

　　除IVFET超促排卵组因行穿刺采集卵子而不计其中外，其他三组共39人采用B超监测排卵。结果有28人排卵，11人未排卵。排卵组与未排卵组的CM中的TNFα比较结果显示，排卵组TNFα水平明显高于未排卵组，差异有显著性(P<0.05)。

　　3  讨 论

    近年来，研究发现免疫系统对女性生殖内分泌有重要的调节作用，但确切机制尚未阐明[3]。TNFα与女性生殖关系密切，其主要由单核巨噬细胞合成和分泌，是介导天然免疫反应的细胞因子，具有多种生物学效应[4]。本文研究显示，正常对照组女性CM中TNFα在卵泡期、围排卵期、黄体期分别为：(0.39±0.22)μg/L、(1.18±0.26)μg/L及(0.59±0.34)μg/L，围排卵期TNFα水平最高，与其他两期比较有显著性差异(P<0.05)。可能与卵泡破裂时，卵泡液刺激巨噬细胞释放TNFα，并使其参与卵泡壁的降解，有利于卵细胞排出有关。另有学者发现，卵巢颗粒细胞和巨噬细胞能分泌TNFα，子宫内膜上皮细胞及间质细胞也能分泌TNFα[5]。而且，FSH能促进TNFα的分泌，LH和CSFI可放大这一作用。进一步的研究表明，COH组卵泡液中TNFα水平高于正常月经组，认为促性腺激素(Gn)可能调节卵巢分泌细胞因子。本研究显示，在三组促排卵方案中，HMG组、IVFET组CM中TNFα在围排卵期显著高于正常对照组及CC组(P<0.05)，可能与外源性Gn药物对TNFα的上调作用有关，而IVFET组在使用GnRHa降调节中对CM中TNFα的水平无显著影响，三组在生殖周期的变化趋势与正常月经周期相似，即卵泡期开始上升，排卵期达高峰，黄体期回落。

    卵泡的生长发育受众多因素调控，如促性腺激素、雌激素、雄激素、胰岛素样生长因子、卵泡抑制素和激活素及多种细胞因子等。TNFα能诱导多种细胞凋亡，颗粒细胞和卵母细胞是其靶细胞。早期卵泡体外无血清培养时出现自发凋亡，如加入FSH可抑制60%的卵细胞凋亡。而FSH的作用又可被TNFα抑制，说明TNFα能诱发早期卵泡凋亡，参与调节卵泡闭锁[6]。有研究发现TNFα对生殖过程具有双向性，生理浓度的TNFα有利于早期卵泡发育和黄体维持，而超过生理浓度的TNFα则抑制颗粒细胞E2的合成和卵泡膜细胞雄烯二酮的合成，从而影响卵泡及早期胚胎的发育[7]。我们的研究发现，围排卵期HMG及IVFET在促排卵组中TNFα水平较正常对照组及CC组高(P<0.05)，同时两组围排卵期卵泡发育良好，考虑促排卵时使用外源性Gn对TNFα有上调作用，但TNFα的水平仍在正常生理范围内，故未对卵泡发育产生不良影响。我们的结果还显示，CM中TNFα水平在正常范围内与卵泡大小成正相关(r=0.261, P<0.05)，与子宫内膜厚度也成正相关(r=0.183, P<0.05)，推测CM中TNFα在某种程度上能反映促排卵卵泡的发育情况。

    大鼠卵巢灌注实验表明，外源性TNFα有显著增加LH诱导的排卵率。本研究结果表明，未排卵组与排卵组相比TNFα有显著性差异(P<0.05)，排卵组TNFα水平较高。推测TNFα虽在排卵前可维持卵泡壁的稳定性，但可能在排卵时参与了卵泡壁的降解，导致排卵的发生。另外，高浓度的TNFα进一步促进排卵前颗粒细胞及卵泡膜细胞合成大量的前列腺素，亦可参与排卵的发生。

【参考文献】  　　[1]林守清. 生殖内分泌学 [M]. 北京：人民卫生出版社，2006:627630.

　　[2]庄广伦，周灿权，梁晓燕. 现代辅助生殖技术 [M]. 北京：人民卫生出版社.2005:1214.

[3]李爱军. 子宫内膜异位症患者腹腔液及血清中白细胞介素12和肿瘤坏死因子α检测 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2006, 41(4):728730.

　　[4]Terranova PF. Potential roles of tumor necrosis factorα in follicular development, ovulation, and the life span of the corpus luteum [J]. Domes Animal Endocri, 1997, 14(1):115.

　　[5]Yamauchi N, Harada T, Taniguchi F, et al. Tumor necrosis factora induced the release of interleukin6 from endometriotic stromal cells by the nuclear factorkB and mitogenactivated protein kinase pathways [J]. Fertil and Steril, 2004, 82(3):10231028.

　　[6]EggertKruse W, Kiefer I, Beck C, et al. Role for tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 1beta (IL1β) determination in seminal plasma during infertility investigation [J]. Fertil and Steril, 2007, 87(4):810823.

　　[7]Chae HD, Hong SH, Hong SH, et al. Influence of tumor necrosis factora on setradiol, progesterone, insulinlike growth factorII, and insulinlike growth factor binding protein1, 2, and 3 in cultured human luteinized granulose cells [J]. Eur J Obstet Gynecol, 2007, 131:176181.