一氧化氮对大鼠肠神经干细胞增殖与分化的影响

一氧化氮(nitric oxide,NO)调控中枢神经干细胞增殖分化，导致在中枢神经系统发育中有不可替代的作用川。目前脑神经干细胞与肠神经干细胞(enteric neural stem cells,ENSGs)的生物学特性既存在类似性又有差异性川，可能肠神经千细胞分化产生的细胞更接近于肠道的神经类型，易于肠神经系统重建，故与中枢来源的神经干细胞相比，理论上肠来源的神经干细胞是治疗肠神经肌肉疾病更为适合的移植供体。本研究通过增加外源性N()或减少内源性N()，观察外源性N()对大鼠肠神经干细胞增殖分化的影响，为今后肠神经干细胞移植治疗小儿肠神经肌肉疾病的实验研究提供依据。

材料和方法

一、实验动物孕15d，清洁级SD大鼠.体重不拘.由中国科学院上海实验动物中心提供(动物质量合格证编号:SCXK(沪)2007-0005。本实验设计符合动物保护条例并经过医学院动物保护委员会批准。

二、主要试剂DMEM/F12培养基、2-琉基乙醇(2-Mercaptoe山-anol),N2/B27-supplement(Gibco公司)，Retinoic acid、重组人碱性成纤维细胞生长因子(Human re combinant bFGF)、表皮生长因子(EGF),5-浪脱氧尿嚓咤核昔(BrdU>、胶原酶(Collagenase crude cell cu1-ture)(Sigma公司)。小鼠抗大鼠BrdU(C:ST公司)，小鼠抗大鼠I'uj-1(abeam公司)，小鼠抗大鼠Nestin(BD公司)，兔抗大鼠nN(}S(abeam公司)。DyI_ight488标记山羊抗小鼠I茄(KPI，公司):N()试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Annexin V-FI""I}}细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基公司)。丫、实验方法

1提取培养参照朱利斌等田的方法:孕鼠颈椎脱臼处死，用显微手术器械除去肠管浆膜及周围结缔组织获得胎鼠肠管(末剥取含有肌间神经丛的外纵肌)，剪切、胶原酶37'C消化30 min,200目筛网过滤、离心后弃去上清.改良的ENSCa培养基(未添加鸡胚浸出液LEE)重悬细胞，台盼蓝染色计数，1.0x-106个/ml接种于未预先用HFN包被的25 ml培养瓶中，370C,50oC02、饱和湿度培养箱，24 h半量换液，以后每隔?d半量，约每5-}-6 d传代1次，反复传代，进行免疫学鉴定，本研究另外进行传代培养后肠神经球BrdU免疫荧光染色。

2.实验分组原代肠神经干细胞培养5-}-6 d形成神经球，吹打十消化呈单细胞悬液并重新接种到12孔板进行传代培养(细胞密度为106个/m1>,分1组:150}mol/I二乙烯=胺/一氧化氮聚合物CDETA/NOD，简称D50;②100}mol/L N一硝基一L精氨酸甲酷I=NAME>，简称L100;

3 50 umol/L二乙烯三胺/一氧化氮聚合物+100}cmol/L N一硝基一I、精氨酸甲醋，简称D50+L1 E)0;①对照组，每组3孔。传代培养24 1:后，每组1孔加人BrdU，其终浓度为((20}mol/I)，每组继续孵育?4 h，共48 ha 3.48 h后显微镜镜下观察各组神经球大小。

4.N<)浓度测定硝酸盐还原酶法测出各组药物十预IS 1:后细胞上清液中N()浓度(按南京建成生物下程研究所提供的方法检测)。

5.流式细胞仪测量各组培养48 h后的细胞凋亡率;各组BrdU标记增殖细胞、肠神经干细胞标记物中间丝状蛋白一神经巢蛋白(Nestin)、子代细胞神经元标记物,I`uJ一1所占的百分比。四、统计学处理各组阳性细胞百分比、凋亡率、一氧化氮浓度均以x.士、表示(重复3次),SPSS场.()进行单因素方差分析，方差齐者进行工SD检验，方差不齐者进行Dunnett's T3检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、肠神经卜细胞的提取与鉴定本实验组既往已报告肠神经干细胞提取及鉴定方法3斗一。未包被的肠神经干细胞培养第五天形成典型神经球，直径约200 nm，较以往包被培养的肠神经千细胞形成神经球时间稍有缩短，周围未见放射状神经丝形成(图1)。传代培养后两组肠神经球BrdU免疫荧光染色都显阳性(图2>，结果进一步证实提取的肠神经干细胞具有进一步增殖的潜能。

二、各组一氧化氮上清检测肠神经干细胞传代培养48 h后，D50组、D50+I_100组、L100组以及对照组细胞上清液一氧化氮浓度分别为(51.94士12.43)}cmol/L,C 38.73士7.95)}mol/L,(16.24士12.25)}mol/I、C 30.27 1 18.52)}cmol/L,D50组上清液一氧化氮浓度明显高于对照组(PGO.05),L100组则明显低于对照组(PGO.05),D50+I_100组与对照组无统计学意义(PGO.05)。

三、显微镜观察各组神经球的形态大小D50组的神经球直径较小，空白组及L100组较大，D50+L100组介于两者之间(图3-v6)o

四、流式检测各组阳性细胞百分比传代培养48 h后，D5)组、D50+L100组、L100组以及对照组的①BrdU标记阳性百分比分别为(5.33士0.55)%、(9.13士2.05)%、(16.33士2.52)0 o,C8.90士1.49)0 o;②Nestin阳性细胞白一分比分别为(16.57士1.45)0 o,C 20.67士1.40)00,(38.67士2.08)0 o,<22.37士1.82)0 o,D50组明显低于对照组(PGO.05),L7 00组明显高于对照组(P<(〕.05)，而D50+I_100组与对照组无统计学意义;3}Tuj-1阳性细胞百分比分别为(25.59+2.78)00,(13.89士1.40)%、(7.71士().61)%、(11.14士1.33)00，统计显示发现与Nestin,BrdU阳性细胞百分比与对照组关系恰好相反。

五、各组细胞凋亡率测定传代培养48 h后，D5)组、D50+L10()组、I_100组及对照组的细胞凋亡率分别为(13.40士8.94)00,(10.93士2.38)%、(11.33士2.h4%、(12.70士3.01)0 o，实验组与对照组间差异均无统计学意义(Y>0.05)0讨论中枢神经系统功能的发育和成熟与相关组织细胞的增殖和分化有关。近年研究发现NO参与了神经系统功能成熟发育的调控团，体现在神经轴突生长、突触的建立、神经递质传送及神经干细胞的增殖、分化的调控等方面。增殖和分化是神经干细胞发育中相互联系的生长过程陌。理论上肠神经系统来源的神经干细胞，更适合移植治疗小儿肠神经肌肉疾病.NO对肠神经干细胞的增殖和分化干预的研究，有助于肠神经干细胞移植治疗的应用。研究NO对神经系统在体内外的影响的供体种类繁多，而IETa'NC)是一种人工合成的N()供体之一，它无需酶的催化，释放速率仅受温度和酸碱度的影响.半衰期较长，在}70C为20 h，适合体外实验的长时程观察。体内催化N()生物合成的酶为一氧化氮合酶NOS)，NS以L-精氨酸(L-Arg)和分子氧为底物，生成N()和L-肌氨酸。目前常用的NOS抑制剂有L-NAME和7-硝基叫噪(7-NI)}-，它们常被用来研究NO对神经干细胞增殖分化的影响。因N()化学性质活泼，在培养基中代谢易转化为硝酸根(NC?})和亚硝酸根(N(>=)，故本研究通过硝酸盐还原酶法，能完全将NOj转化为NO认比传统采用金属镐还原法方便、稳定、准确。本实验通过在肠神经干细胞培养中加用外源性N()供体I}ET八/NO，及内源性NO合成的关键酶N()S抑制剂I_-NAME，进行神经干细胞增殖和分化相关指标的研究，证实DETA/NO在肠神经干细胞培养中能释放NO，使细胞培养液中外源性N()含量增加;而NOS抑制剂L-NAME相比于对照组，明显减少培养液中NO浓度，能够达到进行NO对大鼠肠神经十细胞增殖与分化研究的目的。L-NAME明显减少培养液中NO浓度的原因可能是NOS活性的抑制导致内源性NO产生减少。形态学观察发现，D50组和D50。

组神经球直径小于对照组和L10组中的神经球直径。神经球是神经十细胞自我分裂及其不同分化阶段的后代细胞的集合体四，神经球大小反映增殖能力大小。故本研究结果表明，DETA/NO能抑制肠神经十细胞增殖，L-NAME则促进肠神经干细胞的增殖Nestin作为神经干细胞经典的生物学标记.随着分化的开始，Nestin表达量逐渐下降。Tuj-1是神经元特异性俘班微管蛋白，其抗体常用于标记分化早期的神经元，包括有丝分裂中的神经母细胞及分裂后的神经元，被认为是干细胞向神经元分化的最早标志之一。BrdU只能在细胞分裂增殖期才能掺人到细胞DNA中，是反映细胞增殖情况的最佳指标。故本研究用Nestin,BrdU及丁uj-1作为肠神经干细胞、增殖期细胞、神经元免疫荧光的标记物。戴毅等阳口报道成熟的神经元和神经胶质细胞不具有分裂增殖能力，而神经干细胞在体外环境下进行培养，具有自我复制和不断增殖能力。本研究BrdU的合成量就间接反映了肠神经干细胞增殖和分裂能力。本实验应用流式检测了各组肠神经干细胞Nestin、增殖期细胞BrdU及子代细胞神经元t uj-1的含量，发现D50组相对于对照组.神经干细胞Nestin、增殖细胞BrdU的百分比均降低、神经元tuj-1的百分比升高;加人L100后则效应相反。

研究发现Nestin阳性细胞百分比与BrdU阳性细胞百分比的变化趋势一致，提示DETA/NO抑制肠神经干细胞增殖、促进向神经元分化;而L-NAME则促进肠神经十细胞的增殖、抑制向神经元分化。流式检测各实验组细胞凋亡率与对照组比较无差异，提示上述的药物干预作用并非通过药物本身毒性效应来促进肠神经干细胞的凋亡、抑制神经干细胞的增殖的，而是通过NO的调节机制来发挥作用的。近年来有报道NO能体外抑制大鼠小脑神经干细胞、人神经母细胞瘤细胞(SK-N-BE>增殖，并通过cGMP-Rb-E2F信号通路下调原癌基因N-Myc来调节细胞增殖分化. Torroglosa等，一研究证实NO是通过抑制神经干细胞胞膜上EGF受体的激活，进而影响下游分子如磷酸酞肌醇-3-激酶(PI3K>/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AktCPKB>及p27Kip1来抑制小鼠NSCs的增殖，期间并未发现cGMP信号通路及MAPK信号通路参与了神经十细胞增殖分化过程。I_uo等l4}研究证实来源于神经元胞质中的NO为外源性NO，其抑制神经干细胞增殖的现象是通过下调cAMP反应元件结合蛋自(CREB>活性，依次下调NOS在神经干细胞中的表达来实现的。而来源神经千细胞细胞核中的Nos，通过激活端粒酶活性，来促进增殖，说明神经干细胞胞质中Nos才是神经干细胞增殖分化的关键因子。

Yoneyama等防三发现NO也存在cGMP/PKG介导的信号通路，促进海马神经干细胞增殖。鉴于肠神经干细胞与脑神经干细胞生物学特性既有类似性又有差异性，\r()能够通过上述不同信号机制来参与调控脑神经十细胞增殖分化，结合本实验发现No及其Nos抑制剂对肠神经干细胞增殖和分化的调节效果.提示可应用于肠神经系统神经元缺陷性疾病治疗的研究，用来解决肠神经干细胞体外培养和扩增过程中的调控、及向某种细胞类型的诱导分化，以利达到更好的移植效果。

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