利多卡因对幼鼠肠缺血—再灌注损伤肠组织TNF-α、ICAM-1表达的影响

肠道是缺血一再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤最敏感也最易受伤的器官之一，I/R后组织发生的急性炎症反应对机体起到了一定的保护作用，但过度的反应将对机体造成损害C}-37。本研究结合小儿常见的肠I/R问题C}-}7，通过检测幼鼠肠IiR后组织中肿瘤坏死因子a(TNF-a)和细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达，探讨利多卡因对肠工/R损伤保护作用的机制。材料和方法

一、实验材料

1.实验动物4周龄SD大鼠，SPF级，动物编号:许可证SCXK(渝)2007-(>17，体重(10t，士15)g0手术室温度25 0C^-27 0C，相对湿度5000^65000 

2.实验试剂10%水合氯醛溶液(大理学院附属医院制剂室配制);盐酸利多卡因注射液(sml:0.1 g，上海朝晖药业有限公司)。TNF-a免疫组化检测试剂盒(工作浓度1:200),ICAM-1免疫组化检测试剂盒(工作浓度1:500)，即用型SP试剂盒，DAB显色试剂盒和羊抗鼠二抗免疫组化试剂盒等均购自福州迈新生物技术开发公司。

二、方法

1.动物分组SD大鼠共48只，雌雄不限‘随机分为3组，假手术组(Sham组).肠I%R模型组((I R组)及利多卡因于预组(Lid组)。每组16只。

2.动物实验用10%水合氯醛溶液腹腔内注射((3 ml/kg)麻醉后仰卧位固定，腹部去毛.消毒后取上腹正中纵行切口，依次切开人腹，寻找并游离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery.SMA)根部，用橡皮条阻断肠系膜上动脉血流60 min，松开橡皮条，恢复肠系膜血流，造成小肠I/R模型。I,}R组于再灌注前经股静脉注射生理盐水0.5 m工，而Lid组经相同途径注射利多卡因2 mg/kg(稀释在0.5 ml的生理盐水中),Sham组动物在开腹后不做任何干预，于再灌注后30,60,90120 min 4个时间点每组各处死动物4只，取距回盲瓣5 cm处近端2 cm长的小肠作为标本备做免疫组织化学研究。

3.免疫组织化学染色及结果判读将所取小肠组织制成6^-8}m厚度的切片后，用SP法DAB显色进行免疫组织化学染色显示TNF-a,ICAM-1的表达，PBS液代替一抗作为阴性对照。光镜下观察，以小肠组织细胞胞质出现棕黄色颗粒状或匀质状物为免疫反应阳性细胞，阴性对照细胞胞质或胞膜不着色。用HM工AS-2000型高清晰医学彩色图象分析系统测量光密度值(OD>，每个观察时间点每组选16个视野(每组4只幼鼠各取2张切片，每张切片随机选取2个视野)分别测量，计算OD值的均值作为此组该时间点的测量值。

三、统计学处理用sPSS11.o软件分析，各组资料以x士、表示，组间进行单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，以PGO.05表示有统计学意义。

结果

小肠I/R模型制作的各手术环节均顺利，成功获得肠I/R模型，实验观察期间无动物死亡，肠组织发生了缺血性损伤和炎症反应并有随再灌注时间延长而加重的趋势(图1 A-}-D>，经利多卡因干预后损伤程度略有减轻(图1 E-}-F)o

一、TNF-a免疫组织化学染色检测结果肠组织免疫组织化学染色后，TNF-a在各组肠组织细胞中均有表达，但在正常肠组织中仅为弱阳性表达，而在I/R组和Lid组则为强阳性表达，尤其I'一R组.呈不规则的片状高表达(图2A-}-C)。通过测定各组TNF-川卿吐表达区域的OD值，从再灌注3l)min开始在I,'R组肠组织中TNF-a呈持续的高表达状态，尽管Lid组也呈现高表达，并呈现轻缓的上升趋势.但各时间点测得值均未达到I/R组相应的水平.两组均以再灌注90 min时为最高，120 min时的测得值略微回降。通过对测得值进行方差分析，组间比较，I/R组和Lid组的测得值均高于Sham组，差异有显著性(PGO.05).而以I/R组的测得值为最高并高于Lid组，差异有统计学意义(PGO.05，表1)

二、ICAM-1免疫组织化学染色检测结果各组肠组织中ICAM-1均有表达，但在正常肠组织中仅为弱阳性，而在I/R组和Lid组则为强阳J睦表达，尤以工/R组内ICAM-1呈现深染的强阳性表达(图2D-}-F)。通过测定各组工CAM-1阳性表达区域的()D值，从再灌注30 min开始I/R组和Lid组肠组织中ICAM-1表达的()D值即增高并呈逐渐升高的趋势，但以I/R组测得值增高更为明显，两组均以(90 min时表达最多，120 min时略微回降。通过统计学处理，C)D值在组间比较，I/R组和Lid组的测得值均高于Sham组，差异有显著性(P>0.05);尽管从再灌注30 min开始I/R组和Lid组肠组织中ICAM-1表达的OD值即增高，30 min和60 min时OD值在这两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，但90 min和120min时I/R组ICAM-1表达的OD值的升高较Lid组更为明显，差异有显著性(P>0.05，表2)。讨论I/R导致再灌注肠组织在原缺血造成损伤的基础上组织损伤进一步加重，形成再灌注损伤，主要表现为组织病理损伤和由此介导的炎症反应。对造成I/R损伤的机制有诸多研究报告，但均缺乏统一认识，其中“呼吸爆发(respiratory burst)”和“无复流现象(no-reflow phenomenon)”被认为是诸多机制中存在的较为合理的现象，中性粒细胞((PMN)活化是重要环节，川。活化后的PMN聚集增加，不仅产生大量的氧自由基损伤组织，而且通过脱颗粒作用释放弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶和髓过氧化物酶等多种蛋白酶，分解胞外纤维与基质，基质连接受损。不论是大量的动物实验还是对来源有限的人体刀R肠组织的研究均表明，肠组织中TNF-a和ICAM-1呈现高表达状态8-10。本研究通过检测幼鼠肠I/R后和利多卡因干预后肠组织中TNF-a和ICAM-1的表达，试图对肠I/R损伤的机制及利多卡因对肠I/R损伤的影响作一探究。幼鼠肠UR发生后，肠组织中TNF-。在再灌注的120 min内都呈现持续的阳性高表达状态，随再灌注时间的延长仅呈轻缓的上升趋势，而120 m1n时()D值有所回降，但各时间点测得值间的差异无统计学意义。

然而，与TNF-a的表达相比，尽管ICAM-1在I/R肠组织中也呈现阳性高表达，但测得的ICAM-1阳性表达的C)D值是从再灌注后30 min开始逐渐升高，直到90 min呈现表达的峰值，此时的测得值达到30 min时的2倍多，即使在120 min时稍有间降，但整个观察期内均表现出随再灌注时间延长而逐渐升高的趋势.与组织学改变一致曰。在I%R发生后，再灌注组织迅速发生了炎症反应，大量中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润，P VIN被活化，启动了单核巨噬细胞系统的防御功能一也触发并产生炎性介质和TNF-a等细胞因子释放人血液循环，因而，在本实验检测到组织再灌注后一早期组织内TNF-a的表达即明显增加。而TNF-a与其受体结合后通过多种细胞通路激活转录因子，尤其是核转录因子一:B(nuclear factor-kappa B.NF-rcB)，不仅使单核巨噬细胞分泌大量炎性因子.也通过上调如TNF-。及ICAM-1等的表达.使更多已活化的PMN与微血管内皮细胞粘附增加，从而加重组织缺血甚至发生无复流现象.以致组织细胞级联放大的炎症反应，加重血管内皮细胞和血管平滑肌细胞损伤及组织破坏，这也就在一定程度上解释了本实验结果中TNF-。和ICAM-1高表达及增加趋势存在时间差的现象。利多卡因干预后，尽管TN F-a和工CAM-1的表达仍高于正常肠组织，但较未经干预I/R肠组织中的表达明显减少，这说明利多卡因能通过加强细胞膜的稳定性，保护了细胞不受或少受损害因子的侵害，在一定程度上避免或减少了包括TNF-。在内的细胞因子的释放。有研究表明，利多卡因可通过抑制中性粒细胞游走、超氧阴离子和炎症介质的释放及ICAM-1的表达等而发挥抗炎作用，从而减轻由于炎症造成的组织损害并促进肠勃膜屏障的修复和肠平滑肌功能的恢复。

因此，利多卡因干预后肠组织损伤程度较轻，产生的细胞因子和炎症介质也减少，也就降低了TNF-a和工CAM-1的表达，但由于缺血时即发生了组织损伤，在组织再灌注发生后即使存在利多卡因的作用，TNF-。和ICAM-1的表达仍高于正常组织。J总之，发生肠到R后，幼鼠肠组织TNF-a和ICAM-1均呈高表达，但两者增加趋势有时间差现象，利多卡因对肠组织I/R损伤有一定保护和限制作用，表现为肠组织TNF-cx和ICAM-}表达减少。

参考文献

[1]Veichapipat P,Williams SR,Spitz L.Intestinal metabolism after ischemia reperfusion[J].Journal of Pediatric Surgery,2000,(05):759-764.

[2]Stallion A,Kou TD,Latifi SQ.Ischemia/reperfusion:a clinically relevant model of intestin al injury yielding systemic inflammation[J].Journal of Pediatric Surgery,2005,(03):470-477.doi:10.1016/j.jpedsurg.2004.11.045.

[3]王佳哲,张庆富.小肠黏膜微循环的研究进展[J].中国微循环,2008,(01):61-64.

[4]沈淳,郑珊.小肠缺血再灌注损伤在肠套叠患儿的临床观察[J].中华小儿外科杂志,2005,(10):540-543.

[5]Hall NJ,Smith VV,Harding B.Intestinal ischemia reperfusion injury does lead to acute central nervous system damage[J].Journal of Surgical Research,2005,(02):288-291.doi:10.1016/j.jss.2005.04.036.

[6]刘庆文,林春榕,吴学东.可转录因子NF-κB与肾脏缺血-再灌注损伤[J].中外医疗,2011,(09):185-186.doi:10.3969/j.issn.1674-0742.2011.09.152.

[7]曲文超,林春榕,吴学东.缺血再灌注肺损伤机制的研究进展[J].医学综述,2011,(04):487-489.doi:10.3969/j.issn.1006-2084.2011.04.003.

[8]Ayyagari VN,Januszkicwicz A,Nath J.Effects of nitrogen dioxide on the expression of intercellular adhesion molecule-1,neutrophl.l adhesion,and cytotoxicity:studies in human bronchial epithelial cells[J].Inhalation Toxicology,2007,(02):181-194.

[9]Grootjans J,Lenaerts K,Derikx JP.Human intestinal ischemia-reperfusion induced inflammation characterized:experiences from a new translational model[J].American Journal of Pathology,2010,(05):2283-2291.

[10]李春艳,肖福大,于明.幼鼠肠缺血再灌注损伤时TNF-α的产生及作用[J].中国医科大学学报,2002,(04):241-243.doi:10.3969/j.issn.0258-4646.2002.04.001.