慢病毒介导的shRNA靶向干扰β-catenin神经母细胞瘤稳定细胞株的建立

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是小儿最常见的腹部恶性实体肿瘤，但病因及发病机制迄今尚未完全明了，目前研究表明其是一种胚胎发育性肿瘤，胚胎发育的异常与神经母细胞瘤的发生密切相关}7}俘-catenin是Wnt通路的关键调节因子，它不仅调控胚胎许多发育的过程，而且与肿瘤的发生密切相关。为了探讨所catenin在神经母细胞瘤的发生及发展中的作用，需要有合适的细胞模型。本实验通过构建干扰(3-catenin的慢病毒重组质粒，建立稳定靶向干扰份catenin表达的神经母细胞瘤细胞株，为研究牙catenin在神经母细胞瘤发生中的作用提供了可靠的细胞模型。

材料和方法

一、材料

1.细胞株人神经母细胞瘤细胞株BE2C购自中科院上海细胞研究所，慢病毒包装细胞293T细胞株、大肠杆菌菌株DHSa,Lentivirus-NC病毒液均由上海吉玛公司提供。

2.试剂DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco)，Lipofectamine 2000，Trizol(Invitrogen)，Reverse Transcriptase(Promega)，Taq DNA Polymerase(TAKARA)，兔抗(3-catenin单克隆抗体(Cell Signaling公司),DNA链及引物(上海生工)。

二、实验方法

1.细胞培养BE2C细胞，常规培养使用含10 0 o FBS的DMEM培养基(含1.5 mmol!L L-Glutamine，100 U/ml penicillin,100 ug/ml Streptomycin)中，370C,50oCO}饱和湿度培养箱。

2.Real-time PCR检测(3-catenin在BE2C细胞株中的表达收集人神经母细胞瘤BE2C细胞株.Trizol法提取总RNA，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA,18s rRNA和28s rRNA条带.三条条带完整。取5川总RNA做逆转录反应，逆转录反应体系20川,PCR所用引物均采用Primer 5软件设计，俘-catenin上游引物为5'-GTGCTGAAG GTGCTATCTGTCTGC-3'，下游引物为5'-TGAA CAAGACGTTGACTTGGATCTG3。反应体系20}l,cDNA模板2 u1，上下游引物各1}.1,Master Mix定量PCR试剂10}.1，在Mx 3000 Real-time PCR设备上进行如下反应:95 0C,3 min变性;95 0C,30秒，62 0C,40秒，共40个循环。PCR结束采用溶解曲线确定产物特异性。由PCR反应曲线得到Ct值(threshold cycle number，域值循环数)，采用ppCt方法进行相对定量，使用单一的样品来比较未知样品的目的基因的表达。校正公式为:Fold in-duction=2-00c`;ppCt=}Ct目的基因(未知样品)-Ct一管家基因(未知样品)习一[Ct目的基因(校正样品)-Ct一管家基因(校正样品)]。实验结果均为3次独立重复试验结果。分析3次实验结果，观察人神经母细胞瘤细胞株份catenin的表达。

3.Western blot检测(3-catenin的表达用细胞裂解液提取BE2C细胞总蛋白浓度，BCA法测定蛋白浓度后将30}g蛋白进行10 0 o SDS-PAGE电泳分离并转移至PVDF膜，(3-catenin及c-myc抗体室温杂交2h，以GAPDH为对照，杂交后PVDF膜在室温下分别与羊抗兔及羊抗鼠IgGHRP孵育1h，用SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates法进行曝光检测蛋白表达。X线片记录结果。

4.设计针对汗catenin的shRNA干扰靶点序列及合成shRNA序列以所catenin的CTNNBI基因为模板，设计4条shRNA干扰序列和1条阴性对照序列(表1)。每条核昔酸序列以正反向组合，中间添加loop环(TTCAAGAGA>，正义链模板的5’添加GATCC，与BamH工酶切后形成的粘端互补，反义链模板的5’添加AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补。从GenBank数据库BLAST分析，siRNA(3-catenin序列(CTN'_VB1 NM-001904)无其他同源序列合成后的shRNA序列如下:①G1-S:5'-GATCCGGATGTGGATACCTCC CAAGTTTC.AGAGAACTTGGGAGGTATCCAC ATCCT丁TTTTG3’-AS:5’-AATTCAAAAAAG GATE丁GGATACCTCCCAATTCTCTTGAAAC TTGGGAGGTATC.CACATCCG3’;②G2-S:5’-GATCCGGTTAATAAGGCTGCAGTTATTTCA AGAGAATAACTGCAGCCTTATTAACCTTTT TTG3'-AS:5'-AATTCAAAAAAGGTTAATAA GGCTGCAGTTTTCTCTTGAAATAACTGCAG CCTTATTAACCG3’;③G3-S:5’-GATCCGCTT ATGGCAACCAAGAAAGCTTCAAGAGAGCTT TCTTGGTTGCCATAAGCTTTTTTG3'-AS:5’-AAGAAAAAAGCTTATGGCAACCAAGAAA GCTCTCTTGAAGCTTTCTTGGTTGCCATAAG G’;④G4-S;5'-GATCCGCTGATCTTGGACT TGATATTTCAAGAGAATATCAAGTCCAAGA TCAGCTTTTTTG3'-AS:5'-AAGAAAAAA GCTGATCTTGGACTTGATATTCTCTTGAAA TATCAAGTCCAAGATCAGCG3’;⑤NC-S:5’-GATCCUUCUCCGAACGUGUCACGUTTTTCA AGAGAACGUGACACGUUCGGAGAATTTTT TTTG3，-AS:5’-AATTCAAAAAAUUCUCCGA ACGUGUCACGUTTTTCAAGAGAACGUGACA GUCGGAGTTG3’。

5.构建汗catenin shRNA的质粒表达载体以G1为例，将2条前体DNA单链复性，形成的双链在5’和3’端形成BamHI和EcoR I勃性末端。与用Bam H F EcoR工酶切后的PgLV-H1-GFP+Pu-ro质粒载载体接，转化DHSa感受态大肠杆菌，挑取阳性菌落，根据Q工ANGELA质粒抽提试剂盒说明书提取质粒，进行酶切及测序，测序引物为:5'-TG CATGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3。

6.慢病毒滴度的检测采用逐孔稀释法测定滴度，测定前1d在%孔板中接种293T细胞3X10+个/孔，常规培养24 h后，8孔为一组，在第一孔中加人待测的病毒液10尽，混匀后依次做1()}1倍比稀释。24 h后加人10(>浏完全培养基。72 h后观察荧光表达情况，如前1孔阳性细胞较多(>5个).而此孔及以后荧光消失;或如以后各孔荧光消失而此孔阳性细胞较少(G5个)，则此孔可作为计量孔.计算病毒滴度。病毒滴度=计量孔带荧光细胞数一/病毒原液量。

7.慢病毒的包装将293T细胞传人6孔板中，感染时细胞密度控制在70%一8()0 o。取65川RNA-mate加人250 ulOpti-MEM中，混匀后静置15 min。取40}g目的质粒，1}g包装质粒PgLV-H1-GFP+Puro和0.4}cg包膜质粒PMD2G加人250川Opti-MEM，室温孵育5 min，将质粒稀释物和RNA-mate稀释物混合，室温孵育20 min。将混合物加人293T细胞中，继续培养至72 h,40C,2000 r/min(离心半径84 mm)离心3 min收集病毒上清，0.45}m PVDF滤膜过滤，过滤后，取15 ml病毒液到纯化管内进行高速离心18 min<8000 r/min，离心半径161 mm)。去除底部的废液，离心得到上清液1 ml，即为病毒纯化液。

8.慢病毒感染靶细胞将BE2C细胞接种于6孔板，常规进行培养，感染时细胞密度控制在7000-80000 6孔板每孔分别加人100浏病毒上清液及终浓度为5}.g/ml的Polybrene，加人150 u1含1000 FBS的DIVIEM-F12培养基，培养至48 h,72 h。感染实验分为6组:未转染的BE2C细胞为空白对照组，转染G1-4-(3-catenin质粒为干扰组1,2,3,4,转染GenePharma NC质粒为阴性对照组。

9.稳定细胞株的建立real-time PLR及West-ern blot检测6组受侵染细胞的汗catenin基因及蛋白表达情况，比较差异，选取最佳阳性克隆。配制浓度为4}cg/ml的puromycin筛选培养基，最佳阳性克隆hE2C细胞株在h cm培养皿中培养至80 0 o-}-90%融合时，按5X10'细胞/孔的浓度接种孔板，铺匀后培养过夜。按筛选有效片段相同病毒、稀释比例，侵染细胞，设立干扰组、阴性对照组及空白对照孔。侵染48 h后，加人筛选培养基。维持puromycm浓度，隔天换液，至空白组细胞全部死亡，更换选择培养基，继续培养数天，扩增稳筛株细胞。

10.检测结果Real-time PCR,Western blot检测干扰后汗catenin mRNA及蛋白表达情况。

三、统计学处理采用sPSS15.o统计软件，各组比较采用单因索方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD法.PGO.05为差异有统计学意义。

结果

一、(3-Catenin在人神经母细胞瘤细胞株BE2C中的表达Real-time PCR检测发现在338 by的位置出现了较亮条带，说明份catenin基因表达量充足;同时还发现条带产物单一，未见杂带，说明引物特异性较好，无明显非特异性产物(图1)a Western blot蛋白水平检测结果显示防Catenin蛋白灰度较深，产物单一(图2)。基因及蛋白水平检测结果均表明汗Cate-mn在人神经母细胞瘤细胞株BE2C中的有较好的表达。

二、慢病毒滴度的评价1 ml病毒用%孔板做检测，病毒原液10尽稀释到105后，荧光显微镜下，每个视野10个荧光细胞，一般平均4个视野。计算如下:1 ml病毒滴度=荧光细胞数X4个视野X1(15 C稀释倍数)x 100(10浏体积)，慢病毒的滴度达到1 X 1 C)"TU/ml时，侵染BE2C细胞的效率可达到90%左右(图3)

三、有效干扰片段的筛选慢病毒感染实验在12孔板中进行，感染%h后收样，Real-time PCR校正结果为G1:0.07((l.06一().09);CT2:().18<0.15一().20);G3:().12(0.1()一().14);64,0.11(().09一().14)，而Blank:1.00(0.84一1.19);NC:1.00(0.87一1.14)。Western blot检测各组BE2C细胞汗catemn的蛋白表达分别为G1:(〕.01()士().(川);G2:()川15士().009;G3:().447士(〕川21;64;0.116士().017，而Blank:1.042士()川51;NC:1.012士().065(图4)。Real-time PC;R和Western blot结果显示第一对靶点序列对目的基因的表达与其他各组比较具有显著的敲减作用，因此筛选G1为最佳有效干扰靶点。四、建立稳定靶向干扰汁catenin表达的BE2C:细胞株1.Real-time PCR检测干扰后(3-catenin mRNA的表达Real-time PCR结果采用SPSS13.()统计软件()ne-Way AN()VA方法分析，结果显示BE2C细胞空白对照组(blank的校正值1.00(0.81一1.24)与阴性对照组(NC)0.97(0.81}-1.15)相比，份catenin mRNA表达水平略降低，但表达无明显统计学差异(P=〔).386 W.05;干扰组(G1>BE2C细胞内份catenin mRNA的校正值为().09(0.08一0.11)，较Blank组、NC组表达有明显的减少，敲减效率约为()()%，差异具有统计学意义(尸=0.004,P=().002<0.01)。2.Western blotting检测干扰后份catenm蛋自水平的表达阴性对照组(NC)1.579士(0.095与空白对照组(Blank?1.46，士().211相比，(3-catenin的表达没有明显差异(P=0.469>0.05)，而干扰组(G1)0.007士()川1()与空白对照组(Blank)、阴性对照组(NC)相比，俘-catemn表达量明显降低(P=o.o2,P=0.03<0.05)(图5)。结合Real-time PCR的结果，成功建立稳定靶向十扰份catenin表达的人神经母细胞瘤BE2C细胞株。

讨论

NI3是小儿最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，一旱期转移多，进展期神经母细胞瘤虽经手术、化疗、放疗甚至骨髓移植等综合治疗，仍有很高的复发率及病死率=3}o Wnt拍-catenin信号通路是一条与胚胎发育和肿瘤发生密切相关的信号通路，我们的前期研究已发现Wnt1,(3-catenin和Cyclin D1蛋白在神经母细胞瘤组织中异常升高，且表达的量与神经母细胞瘤分期、组织分型密切相关。因而通过构建干扰份catenin的慢病毒重组质粒建立稳定靶向于扰片catenin表达的神经母细胞瘤细胞株，将为研究份catenin在神经母细胞瘤发生中的作用提供可靠的细胞模型。Wnt币-catenin信号是一条高度保守的信号通路，该通路通过调节TCF家族DNA结合蛋白转录陛质来调控细胞的行为，其核心是胞质内汗catenin的稳定。近年多项实验结果显示，Wnt/俘-catenin信号途径的调控失常与神经母细胞瘤的发生密切相关C}-67。例如，Sangkhathat等通过脂质体转染的方法，使神经母细胞瘤细胞株NB-1过表达(3-cate-nin，结果发现突变型(3-catenin的过度表达可抑制肿瘤细胞的生长，而野生型份catenin的过度表达可促进肿瘤细胞的增殖和神经突的生长延伸，并与基因trkA的表达上调有关。在本实验中我们使用PCR,Western-blo、检测了人神经母细胞瘤株BE2C中份catenin在基因和蛋白水平的表达情况，结果显示汗catenin在该细胞株中有良好的表达，再一次证明了丹catemn与神经母细胞瘤细胞株之间存在一定的相关性。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控一与功能的一项崭新技术，是针对转录后mRN A水平的相关基因的表达沉默。

由于RNAi具有很强的、特异的基因调控能力，现已成为基因功能、人类疾病模型及基因治疗研究的热点仁洲二。慢病毒载体，具有既可转导分裂期细胞和非分裂细胞，又能通过基因整合至靶细胞基因组中实现长期稳定表达，且转导效率较高，免疫反应小，是siRNA的理想载体。本实验结果显示慢病毒的滴度达到1 X 10}TU/ml时，侵染BE2C细胞的效率可达到90%左右，达到干预实验的转导效率，可进行后续稳定转染实验。本实验设计了针对阶catenin mRNA序列，选择了编码区起始密码子下游433,769,1181,2348四个位点的21 nt序列作为千扰的靶点，并选取了一条阴性对照序列，避免了某一位点不能产生基因沉默效应及选取最佳干扰位点，并排除转染序列本身对基因表达的干扰，从而成功构建了汗catenin shRNA慢病毒表达载体。通过对干扰序列抑制基因表达的初步分析，筛选出了最有效的干扰片段G1。

同时，该载体系统带有可表达抗P}吟霉素的抗性基因，慢病毒质粒侵染细胞后，用含有漂吟霉素的培养基对侵染细胞进行筛选，可获得了稳定侵染慢病毒载体的阳性克隆细胞株。实时荧光定量RT-PCR和Westemblot测定BE2C细胞株在稳定抑制(3-catenin后的表达水平，结果显示无论是基因还是蛋白水平，阴性对照组(NC)(3-catenin表达水平较空白组(Blank)略降低，差异无统计学意义(PLO.05)，提示病毒本身可能会抑制细胞内防caten}n量的改变，但这种抑制不会产生明显效果;而干扰组(U1)(3-catenin的抑制效率可达90%左右。以上结果表明针对靶基因的特异RNAi慢病毒感染后获得了明显的干扰效果，证实了我们构建的RNAi慢病毒能在人神经母细胞瘤BFe}.细胞内能够高效、特异、稳定的对份catenin基因产生抑制作用。通过此次实验，我们为进一步研究Wnt/(3-cate-nin信号通路在神经母细胞瘤发生机制及对生长侵袭等影响提供有用的细胞模型，该细胞株既可以从分子水平研究份catenin基因表达抑制后对其土下游基因的影响，也可以直接从细胞水平观察抑制后细胞在体内和体外增殖侵袭能力、致瘤性等指标的变化，从而获得(3-catenin影响神经母细胞瘤发生和发展的直接证据。

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