Smad 7、Smad 3和Smad 2在尿道下裂发病机制中的作用

尿道下裂(hypospadias)是儿童外生殖器最常见的先天畸形之一，新生儿发病率大约为1/250，并呈逐年上升趋势二‘三。该畸形主要表现为尿道开口于阴茎顶端以外的阴茎腹侧、阴囊或会阴区。目前手术矫治是这种畸形唯一的治疗方法，但是，伴随任何一种矫治方式均会有显著的并发症以及造成患儿可能的精神心理阴影。为此，有必要澄清尿道下裂的病因。目前，国内外针对转化生长因子1(TGF-俘7}已有大量研究，已基本明确TGF-俘:过表达与尿道发育和尿道下裂发生密切相关。一系列叫做"Smads”的蛋白能将TGF-尽1信号由细胞膜带人细胞核内。一般地，根据结构和功能的不同可以将Smads分为3级:①通路限制性Smads(Smad 1}2,3,5,8);②普通Smads(Smad 4或Smad 4(3);③TUF-R信号抑制性Smads<Smad 6,7。不同的Smads家族成员在信号通路中有不同的角色。在分析以往的有关Smads相关报道和前期的预实验研究后，本研究中，我们选择通路限制或抑制性Smads成员(Smad 7,Smad 3和Smad 2)进行研究，观察它们在尿道下裂患儿和正常儿童阴茎包皮组织中的表达差异，初步观察Smad 7,Smad 3和Smad 2在尿道下裂发生机制中的作用。

资料与方法

一、材料

1.标本来源及分组本研究收集了重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科病房拟行尿道下裂尿道修复术患儿术中切除的包皮组织(均为阴茎远端包皮)30例，年龄2-V 7岁，平均3.5岁;所有病例均为首次手术矫治患儿，无其他合并畸形，无染色体疾病。同时设立正常对照组:为我院泌尿外科门诊包皮环切术儿童术中切除的包皮组织(均为阴茎远端包皮)，共30例，选择年龄在4-v 5岁，平均3.5岁，基本上与尿道下裂组年龄匹配。本研究得到重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会批准，每次取材均通过患儿家属或监护人的知情同息。

2.实验材料兔二步法检测试剂盒(含300 Hz O:液)和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，封闭用正常山羊血清工作液(北京康为世纪生物技术有限公司)，兔抗人Anti-Smad 7/Smad 6(Smad 7多克隆抗体，bs-0566R，北京博奥森生物科技有限公司)和兔抗人p-Smad2/3(Ser 423/425)单克隆抗体(s}11769，美国Santa cruz生物技术公司)，Prime script逆转录试剂盒(大连Takara生物科技有限公司)，高纯总RNA快速提取试剂盒和2 X SYBR Real-time PCR Premixture(北京百泰克生物科技有限公司)。

二、实验方法

1.标本的制备每例包皮组织标本用无菌生理盐水将血迹洗去后，分为两份，一份立即置于液氮中冻存，另一份用4%多聚甲醛溶液固定48 h0 

2.RNA提取和实时定量聚合酶链反应(qPCR>从液氮中取出新鲜包皮组织，遵照试剂盒说明书提取和测量总RNA量，然后参照前期报道川的方法进行qPCR，建立标准曲线、检测和计算Smad 7,Smad 3和Smad 2 mRNA在各组包皮组织中的相对表达量。候选基因特异性引物和最适退火温度见表1;每个cDNA样本重复3次。

3.免疫组化检测将固定好的组织常规脱水、浸蜡、包埋。5}m连续切片粘附于防脱载玻片上，60℃恒温干燥箱中烘烤过夜(>12 h)。再经脱蜡、水化后，0.01 mol/L构橡酸盐溶液微波抗原热修复15 min，自然冷却至室温;30o H}OZ液和山羊血清先后于室温下封闭15 min，甩去多余封闭液后，立即滴加适当稀释的一抗(遵照抗体说明书Smad 7,1:150稀释;p-Smad 2/3,1:200稀释)，湿盒中40C过夜。滴加兔二抗检测试剂，370C,30 min;滴加新鲜配制的DAB显色液后，显微镜下控制显色时间，苏木素染核30，晾干，中性树胶封片。苏木素和伊红染色(HE)是在切片脱蜡，水化后，先后进行苏木素染核(7 min)和伊红染色细胞质(1 min)

三、统计学处理

实验数据用x士、表示，利用SPSS 16.()统计软件分析，组间比较采用以年龄配对设计的两样本均数t检验，P<0.05为差异有显著性。

结果

一、临床特征共纳人30例尿道下裂患儿包皮标本，其中龟头型2例((6.700)，冠状沟和沟下型6例(20.000)，阴茎体型7例((23.300)，阴茎根型8例(26.600)，阴囊型5例(16.700)以及会阴型2例((6.700)

二、儿童包皮组织中Smad 7,Smad 3,Smad 2 mRNA表达情况Smad 7,Smad 3,Smad 2 mRNA在尿道下裂患儿包皮组织中的表达分别是1.19,1.32和1.14，在正常对照包皮组织中的表达分别是0.60,1.07和0.71;三者在尿道下裂患儿包皮的表达较正常对照包皮表达升高分别是97.000,22.8%和59.900;差异均有统计学意义(P二().002,0.044,0.029，图1)

三、正常儿童和尿道下裂患儿包皮组织中Smad 7和p-Smad 2/3蛋白的表达情况免疫组织化学检测发现Smad 7和p-Smad 2/3蛋白在尿道下裂患儿和正常儿童包皮皮下的间充质细胞层的胞核和胞质中大量表达(棕黄色示阳性表达，排除皮肤基底层细胞色素沉着，图}}3)，以HE染色作为空白参照，很明显，Smad 7和p-Smad 2/3蛋白在尿道下裂患儿包皮组织中的表达相对于正常对照显著增强趋势。

讨论

尿道下裂是儿童最常见的发育缺陷之一，被认为是一种轻型的46,XY性染色体发育异常(DSD>疾病，但其确切的病因仍然未知。本研究中，我们从mRNA和蛋白质及其磷酸化水平上初步观察到Smad 7}Smad 3,Smad 2在尿道下裂患儿包皮中表达较正常对照有显著增强。作为Smads，曾经被认为是TGF-归受体的唯一的底物以及唯一的细胞内介质，其研究多与TGF-R联系在一起。Smad、蛋自介导TGF-俘超家族成员，包括:TGF-沁、激活素、抑制素、骨形态形成蛋白、生长和分化因子等。TGF-a信号通路涉及到多种生物过程的调控，包括:胚胎发育、纤维化、肿瘤、免疫调节和创面愈合。其中有关TGF-俘，过表达与尿道下裂发生密切相关的报道比较多，然而，据我们所知，目前还没有有关Smad 7,Smad 2和Smad 3过表达与尿道发育和尿道下裂发生相关的报道。

因此，通过对已知Smads功能的推测来解释和提供Smads过表达与尿道下裂之间关系的证据显得很有必要。最新报道Ross等川通过对尿道下裂大鼠全基因组芯片分析，发现差异性表达最丰富的区域主要包含TF-俘家族和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)成员;c-J un氨基末端激酶CJNK)作为MAPK成员中非常重要的一员，以往大量研究证实JNK在各种细胞迁移中扮演重要角色。男性外生殖器的形成是一个复杂的发育过程，包括遗传程序、细胞分化、激素信号、酶活性和组织重塑;这些必须以时间和浓度依赖的方式有条不紊的进行叫。在胚胎期雄性外生殖器形成和发育过程中，发现在人类尿道发育过程中，存在尿道璧融合形成尿道上皮缝以及随后的尿道缝重塑过程，任何影响细胞迁移或尿道缝形成和重塑的因素均可能导致尿道下裂。F3askin等叫研究认为尿道上皮缝重塑是通过细胞迁移到达腹侧尿道中部取代残余的上皮细胞实现的，其中由间充质细胞取代上皮细胞。

我们前期研究叫也证实尿道下裂患儿包皮中JNK的表达较正常显著升高。Maire等-l01研究发现Smad 7过表达能诱导活化JNK激酶。故根据F3askin等,_提出的细胞迁移理论，我们推测Smad 7过表达与尿道发育和尿道下裂发生相关，可能是这一过程上游的重要信号传递蛋白。正常雄性性别分化依赖于肇酮代谢水平、雄激素受体功能的正常表达以及雌雄激素之间的平衡有学者证实雌激素受体(ER)抑制TGF-俘诱导的Smad 3活性的激活，同时，TGF-3信号通路能反馈性增强雌激素受体(ER)介导的转录活性。进一步.有研究[r12〕发现雄激素受体(AR)与Smad 3有直接相关;其配体结合区直接抑制Smad 3与Smad一结合元件(SBE)的结合，进而可抑制TGF-,}转录应答。也就是说，AR和ER均能抑制Smad 3的活性，但同时AR通过抑制TGF-俘表达，有减弱TGF-}3对ER的反馈性激活作用;因而在尿道下裂患儿Smad 3表达上调。Tomic等「13]通过对Smad 3基因敲除小鼠的研究也证实了其内源性雌激素水平明显低于正常，以及当TGF-俘升高会刺激雌激素受体转录增强，而Smad 3在介导TGF-}3和雌激素受体的对话交流中扮演重要的角色。

值得一提的是，Smad 2与Smad 3有92%的序列同源性，两者同属于1型受体激酶的底物，被激活素和TGF-R受体所活化，具有通路特异性。本实验中，我们发现尿道下裂患儿包皮组织中Smad 3和Smad 2在mRNA和蛋白磷酸化水平上表达显著增强，而Smad 7亦有相似的增强表达。综上所述，我们推测，在雄性尿道发育的性激素调控信号通路中，Smads蛋白参与了TGF-R和MAPK激酶之间的信号传递，其中Smad 7,Smad 3和Smad 2过表达可能与尿道下裂的发生相关。在本研究中，因为研究人群的局限以及病例数的不太充分可能减弱我们这一推断的说服力。

因此，更大样本量，更加深人的研究很有必要:包括使用尿道下裂动物模型，体外验证各个Smads蛋白与TGF-俘和1VIAPK信号通路之间具体的调控机制，及其对间充质细胞迁移的影响等，将会更加明确Smad、蛋白在单纯性尿道下裂发病机制中的角色。

参考文献

[1]Wang MH,Baskin LS.Endocrine disruptors,genital development,and bypospadias[J].Journal of Andrology,2008,(05):499-505.doi:10.2164/jandrol.108.004945.

[2]Liu X,He DW,Zhang DY.Di(2 ethylhexyl)phthalate(DEHP)increases transforming growth factor-beta1 expression in fetal mouse genital tubercles[J].Journal of Toxicology and Environmental Health,Part A:Current Issues,2008,(19):1289-1294.

[3]Willingham E,Baskin LS.Candidate genes and their response to environmental agents in the etiology of hypospadias[J].Urology,2007,(05):270-279.

[4]李明勇,刘星,吴盛德.c-Jun氨基末端激酶在尿道下裂发病机制的作用[J].中华小儿外科杂志,2013,(01):38-41.doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2013.01.010.

[5]Ross AE,Marchionni L,Phillips TM.Molecular effects of genistein on male urethral development[J].The Journal of Urology,2011,(05):1894-1898.

[6]Abassi YA,Vuori K.Tyrosine 221 in Crk regulates adhesiondependent membrane localization of Crk and Rac and activation of Rac signaling[J].EMBO Journal,2002,(17):4571-4582.doi:10.1093/emboj/cdf446.

[7]Huynh-Do U,Vindis C,Liu H.Ephrin-B1 transduces signals to activate integrin-mediated migration,attachment and angiogenesis[J].Journal of Cell Science,2002,(Pt 15):3073-3081.

[8]Kalfa N,Sultan C,Baskin LS.Hypospadias:etiology and current research[J].Urologic Clinics of North America,2010,(02):159-166.

[9]Baskin LS,Erol A,Jegatheesan P.Urethral seam formation and hypospadias[J].Cell and Tissue Research,2001,(03):379-387.

[10]Maire M,Florin A,Kaszas K.Alteration of transforming growth factor-beta signaling system expression in adult rat germ cells with a chronic apoptotic cell death process after fetal androgen disruption[J].Endocrinology,2005,(12):5135-5143.