不同转移潜能人神经母细胞瘤细胞系KAI1/CD82的表达

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)源于原始神经峪细胞，是小儿最常见的恶性肿瘤之一。早期转移多，就诊时约6000^-70%的病例出现骨髓转移，为患儿的主要死亡原因。探讨NB的转移机制，特别是探讨NB的全身转移机制，对NB的治疗具有重要意义。KA1基因是早期发现的抑癌基因，其蛋白表达产物与CD82具有完全相同的结构，是四跨膜超家族成员，对肿瘤发生发展有一定的抑制作用。我们课题组在前期实验研究中川采用免疫组化方法得出，神经母细胞瘤高转移能力与CD82蛋白表达呈负相关。本实验对有转移和及无转移的神经母细胞瘤细胞系细胞二卫进行RT-PCR检测KAI1 mRNA表达，免疫组化检测CD82蛋白表达，从基因水平了解KAI1/CD82表达水平与神经母细胞瘤侵袭转移的关系。本实验是对我们课题组关于KAI1/CD82在神经母细胞瘤转移侵袭过程中作用的深人和延续。

资料与方法

一、材料

1.细胞系QDDQ-NM细胞匡取自5岁男性患儿，经病理证实为NB,Evans分期为W期，并全身骨骼转移，术中取新鲜肿瘤标本，体外细胞培养，取转移瘤及原位瘤分别建立人神经母细胞瘤转移瘤<t}T}D"}MI)及原位瘤CQDD讣}TM2)细胞系。我们课题组前期研究川中证实C}I)I}Q-NM2细胞侵袭转移能力明显高于QDhqNiVTI细胞。

2.主要试剂胎牛而_清购于美国PTY-clone公司。I)MEM培养卜粉购于美国Csibco公司。R"r-PCR试剂盒购于日本Ia}ara公司，K_\I1及内参}TAPI)H基因PC:R引物由土海生土生物工程公司合成。浓缩型鼠抗人KA工l.}CD}i2单克隆抗体为Abcam公司，免疫组化SP试剂盒购厂北京中杉金桥生物有限公司。I>AL;染色液购于北京中杉金桥生物有限公司。

二、实验方法

1.实验分组及细胞培养根据有无远处转移将细胞分为两组叮组，QPiDqNM?细抱;1I组Q}-Dq\}M 1细胞两组细胞均置干}7 0C、含有5厂C()-的湿化空气的培养箱中培养。1n养液为WMEM高糖培养液(含1()胎牛血清.i;i}:n}青霉素，1()U LL}rnl链霉素)。取对数生长期的两细胞系的细胞进行下述实验

2.KT-PCfZ分析神经母细胞瘤细抱K.-''}I1 mR-!V.1表达①细胞制备:将_L述两组}rY细抱系的细胞均按5X1f”孔预先分别接种在(>孔培养板中，待细胞贴壁?4 h后，加人新鲜的无血清培养基，再培养24 h收集孔内细胞。其中f}孔板的3个孔内的细胞提取RNA，其余3孔则放人载玻片培养细胞进行免疫组化，然后分别提取细胞总R\TA.进行mR}1八表达分析;②RT-PC:R:采用异硫氰酸呱酸性一步法分别提取细胞总RBA.按照说明书进行cD}.1第一链的合成。然后以cI}}1A为模板进行PC'R}根据GeneBank中KAI1基因序列设计引物0328饰).KAII上游5'-GGG TCC_'TCT"I}C;T ACT TC八A"I G C-3’，下游5'-C丁C CTC C丁下CGT CTT CTC ACA G-3'。同时以人(T}PDI-I为内参照(146 bp)，上游5-'TC八"hGG G TG TG八ACC A丁G AGA八一3'，下游5'-TC}A丁GG C}TG TGA ACC ATG AG A A-3'o PCR产物均采用凝胶图像扫描仪拍照并进行条带灰度分析，以与G APDH的比值表示其相对含量。

3.免疫组织化学检测K八I1一CD82表达取工组、11组中放人载玻片孔内的细胞(每组间取20个孔的细胞进行实验).PBS冲洗，4%丙酮固定3U min，免疫组化采用SABC法。每张玻片随机取10个视野，统计阳性细胞数。

三、统学处理

结果

一、k}AI1 mR:}A在两组细胞系中的表达凝胶图象扫描仪条带灰度分析显示.工组KA}1的相对含量为(().4576士().U226;且组为f.U}48士().(iU63,差异有统计学意义(PGl).U5,图l)

二、免疫组化检测CDh2蛋白的表达C,82阳性表达产物呈棕黄色，主要位于细胞膜，细胞质偶有表达。高倍光镜(X刊.)下随机取川个视野观察(图2)，计数阳性肿瘤细胞数，无阳性反应细胞和每张切片的阳性细抱数<10%为阴性.阳性细胞数)1 Ci%为阳性，阳性细胞数)5U%为强阳性川。对两组间C'T)8?的表达情况进行测定，两组间差异具有统计学意义(PGU.U5，表1>}癌细胞株时发现的肿瘤转移抑制基因。KAI1基因位于人染色体11p11.2，大量研究发现，KAI1蛋白在结构上与C:D82完全相同。

CD82是丁M4SF家族成员之一，其具有4个疏水跨膜区和一个较大的胞外亲水区.在胞外亲水区中则含有3个潜在的N端糖基化位点。KAI1基因有一个明显的特点是富含C.pG岛，CpG岛的过度甲基化是多种抑癌基因缺失的原因。该基因结构特点提示KAI1基因在人类组织上的表达存在着多种调控机制困。在多种恶性肿瘤如鼻咽癌、乳腺癌等表达下调，从而赋予这些肿瘤细胞的高迁移、侵袭能力洲。近期有研究一表明KAII通过与其他因子如CD，及CD51跨膜相互作用抑制恶性肿瘤的侵袭转移，与以往广泛认为的与其他抑癌基因如p53等相互作用观点不同〕。

NB易发生远处转移，常致死亡，对Nh转移机制的研究具有重要意义。目前国内外很少关于KAI1/CD82在NB转移等方面的研究。我们课题组前期采用神经母细胞瘤病理切片，利用免疫组化的方法进行了实验，结果示KAI1基因与神经母细胞瘤的侵袭转移呈负相关m。为进一步检测KAI l基因与神经母细胞瘤侵袭转移的关系，我们采用RT-PCR和免疫组化的方法.从基因水平证实KAI1/CD82在神经母细胞瘤转移侵袭中的作用，是对我们课题组研究的进一步深人和完善。在国内，本实验首次应用人神经母细胞瘤细胞系(QDDQ-NM)检测K八I1/CD82的表达。

笔者对20株QD DQ-NM1及(>株QDDQ-NM2进行检测。利用RT-PCR检测不同转移潜能的细胞表达KAI1基因时，我们发现QDDQ-NM2细胞的表达明显高于QDDQ-NM1细胞。KAI1基因在肿瘤发生的早期呈高表达，而在肿瘤进展期或发生转移时低表达，提示该基因的表达呈现双相性改变，即肿瘤早期高表达的KAI1/CD82对肿瘤的恶性进展起抑制作用，而一旦无法维持KAI1/CD82高表达时，肿瘤会生长加速并发生侵袭和转移。由此可见，KAI1/CD82可以抑制瘤细胞的恶性转化以及癌细胞的浸润和转移，并可作为肿瘤预后的一个指标。利用细胞免疫组化法检测不同细胞CD82表达时，我们发现，QDDQ-NM2的CD82表达明显高于QDDQ-NM1细胞。

我们前期研究中一也发现，KAI1/CD82表达的降低与肿瘤侵袭、区域淋巴结转移有关匕。这可能与D82参与细胞与细胞间、细胞与细胞外基质问的反应，这两种反应在肿瘤的侵袭和转移中起相当重要的作用二有关我们前期已利用病理切片研究得出神经母细胞瘤的转移侵袭与KAI甘CD82表达呈负相关一，本研究是上述研究的深人和延续。为更深人探讨KA工1基因表达与}B发生发展的关系，我们将采用更为精确的方法来检测QDDq}1M细胞中KAD/CD8?的表达，应用基因转染等方法研究KAI i/C D8?在神经母细胞瘤转移过程中的作用机制。

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