磷脂酰肌醇3激酶和磷酸化蛋白激酶B在小儿血管瘤中的表达及意义

PI3K/Akt信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进细胞的生存和增殖，同时参与血管形成，在肿瘤的形成和发展中扮演非常重要的角色。近年来。国内外学者对血管瘤的研究提不:血管瘤由增生向退化转变的原因可能是细胞间的信号传递和内皮细胞内基因表达的改变。本文试图比较增生期和消退期小儿血管瘤组织中表达水平的差异，探讨PI3K/Akt信号通路在小儿血管瘤的发生、发展及消退过程中的作用。

资料和方法

一、临床资料收集我院2UU9年至2012年住院期间，未经其他治疗、单纯行手术切除并病理诊断为血管瘤的标本，结合Mulliken分类法和PCN A表达重新分类和分期，取增生期和消退期血管瘤各21)例，其中液氮冻存的增生期和消退期血管瘤标本各11例。男23例，女17例，年龄3个月-6岁，平均18.5个月。

二、研究方法

1.实验试剂兔抗人PCNA多克隆抗体购于北京博奥森公司，PI3-kinase p85aC B-9)购于SAN-TA CRUZ公司，Phospho-AktRabbitmAb购于Cell Signaling公司，DAB试剂盒购于北京中杉金桥公司，SYBR-Rpremix Ex CR TaqTM Time PCR扩增反应试剂盒(TaKaRa code:DRR081 A)、逆转录反应试剂盒(TaKaRa code;DRRU37S)、引物(TaKaRa code:UYD11135)购于日本驻大连TaKaRa公司。

2.免疫组化检测p85}p-Akt的表达所有标本均用10%福尔马林固定，石蜡包埋。制成4}m厚的石蜡切片，并作HE染色。采用免疫组织化学SP法，检测增殖细胞核抗原(PCNA)}p85,p-Akt在血管瘤中的表达。PCNA以人乳腺癌作为阳性对照，一抗浓度为1:80;Akt以人乳腺癌作为阳性对照，一抗浓度为1:100;p-Akt,p85以PBS缓冲液切片作阴性对照，一抗浓度为1:5U0 

3.染色结果的判定阳性细胞必须具备:①细胞结构清晰;②阳性颗粒定位、定性好;②着色明显高于背景。阴性对照采用PBS代替一抗染色。阳性染色定位于胞质和/或包膜，黄染者即阳性细胞，不着色为阴性细胞。p85和p-AKT阳性染色定位于胞质和/或包膜，黄染者即阳性细胞，不着色为阴性细胞。PCNA定位于细胞核中，阳性细胞染色呈棕黄色或棕黑色颗粒，不着色为阴性。每例一切片在400倍光学显微镜下随机选取5个视野，每个视野统计7 00个细胞中的阳性细胞数，按阳性细胞进行分级:X10%为(一)，10%一20%为(+).2()一30%为(料),X30%为(一)。对应颜色判断弱阳性(淡黄色)、阳性(黄色)，强阳性(深黄色)。

4.图像分析使用I_ICA DM1000研究显微镜观察切片，用LICA DFC 280摄像头进行图像采集，每张切片随机选取10个视野，保证在同等条件下拍照存档。用Image-proplus h.0图像分析软件进行图像分析，计算出积分光密度(<IUD)，然后求10个视野平均值作该标本的表达量。

5.RT-PCR检测p85,p-Akt的mRNA液氮冻存的增生期和消退期血管瘤标本各11例，应用RT-PCR检测p85,p-Akt的mRN A表达情况。按Trizo一步法提取血管瘤标本内总RN A,用DEPC;溶解的RNA原液稀释倍后，Multiskan spec-trum酶标仪测定OD260,OD280及OD260/OD280，计算样品Total RNA的浓度。按照说明书要求配制反应体系，依据两步法RT-PC:R试剂盒操作说明进行逆转录。RNA逆转录后，取10 ng cD-NA做扩增，得到标准曲线相关系数保持0.99以上，当扩增效率在(95%一105%之间，非特异性扩增和引物二聚体可排除。依据动力学曲线判定每个样品管中荧光强度增对应扩增循环数(Ct值):Ct值=<Ct1+Ct2+Ct3)/3;}Ct二用内参Ct一目标Ca;}OCt=Ct实验一Ct对照;扩增对数。

三、统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，进行样本均数校正:检验;组内分析或两组间比较采用配对、检验。对等级强度行等级相关秩和检验。RT-PCR值进行独立样本t检验和Pearson相关性检验，PLO.05为差异有统计学意义。

结果

一、血管瘤病理学形态与分期血管瘤增生期细胞团形状不规则，呈膨胀性生长，间隔组织少，可见微血管，管径大小不一细胞排列紊乱、紧密、核大、染色深;消退期血管瘤细胞团不明显，间隔组织多，微血管增多.细抱l}}列疏松(图1,2)o PC;}1A在增生期血管瘤中高表达，在消退期而管瘤中低表达或无表达(图3)

二、增生期血管瘤p8},p-A k:的表达增生期血管瘤1}}},p-Ak、的表达率和表达强度均高于消退期血管瘤(尸((i.U5,1'C().川·图斗、5.表1,2>:增生期血管瘤p85,p一八k。的积分光密度分别为11.23士一}().4乳178.73士3}.-}().消退期血管瘤p85,p-2k。的积分龙密度分别为耗.63士峪.(u,Ei-}.9士21.22,差异有统计学意义(尸<()川)。

三、增生期血管瘤,}8}rnRN:}、p-Aktm}R\A的表达增生期血管瘤p8}mTZ\A,tr:}k;mR\A}l7相对表达值分别为(1.O8(i7士(i.01_36,U,t}(;->1士。.川}7.消退期血管瘤p}5,P-Akt的相对表达值分别为().(i2(?3士:()()9},(I.(132,?-士().川7n.差异有统计学意义，增生期血管瘤的相对表达值明显高一r消退期血管瘤，统计学差异均较大(p<0.01)。

四、相关性分析

p8与p-Ak、的表达呈正相关关系汁.的表达呈正相关关系(r=u.55(73,P}0.()1)a讨论而管瘤是小儿最常见的肿瘤.部分血管瘤可自行消退，但其快速增生和自行消退的机制尚不清楚。近年来，国内外学者对血管瘤的研究提示:血管瘤由增生向退化转变的原因可能是细胞间的信号传递和内皮纤Hi包内基因表达的改变。在绝大多数的人肿瘤细抱中，尸工3K信号通路中的关键}1控因子都发生了明显的突变，导致细胞的存活和生长不再受到环境条件的限制YI3K!Akt信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细咆凋亡，促进细胞周期进展，从而f进细饱的生存和增殖，同时参与血管形成，在肿瘤的形成和发展中份演非常重要的角色。PI3K作为脂质家族成员之一通过节亚基D}5的结构域与催化亚基p110结合后集合到细胞膜上使之活化，PI3K被激活时催化亚基p110特异性磷酸化磷酸肌醇(PI)的糖环D3位点，把底物Ptd Ins(4,5)P2(pIP2)转化为Ptd Ins(3,4,5)P3(PIP3),PIP3以第二信使身份影响下游分子并作用工。PI3K在多种肿瘤中活性明显增高，侵袭能力明显增强。

下调PI3K活性后细胞凋亡作用明显增强，细胞增殖停留在G,期，侵袭能力明显减弱工。本实验中，增生期血管瘤p85的表达率和表达强度均明显高于消退期血管瘤，提示PI3K参与了血管瘤内皮细胞凋亡的调节。Akt作为PI3K/Akt信号通路关键蛋白分子，可作用下游多个靶蛋白与信号通路，Akt磷酸化水平反映整个通路的活性，导致细胞增殖加速、凋亡抑制，蛋白合成增加、代谢加速等生物学效应川。文献报道Akt活化程度的增加介导人类支气管上皮细胞癌前病变和恶变，而在正常细胞中没有表达，且药物诱导凋亡的能力与Ak:活化水平的增加相关曰。本实验中，增生期血管瘤Akt的表达率和表达强度均明显高于消退期血管瘤，提示Akt可能与血管瘤内皮细胞凋亡有关。PI3K是PI3K/Akt/mTOR通路的上游分子，其异常激活可以引起一系列的反应，包括细胞的生长、增殖和转移，上皮细胞向间叶细胞的转变以及血管的生成。当接受来自酪氨酸激酶和CU蛋白偶联受体的信号后，PI3K的p85调节亚基即被募集到临近质膜的部位，p110亚基通过与p85亚基结合把底物Ptd Ins<4,5)P2CPIP2)转化为Ptd Ins(3,4,5)P3 CPIP3}。PIC3,4,5}P3可以和蛋自激酶B C AKT)的N端PH结构域结合，使Akt从细胞质转移到细胞膜上，并在3磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 CPDK1)的辅助下，通过使Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点.

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