槐杞黄对紫癜性肾炎患儿Th17/Treg细胞免疫失衡的调节作用

紫瘫性肾炎(HSPN)是儿科常见疾病，但其发病机制仍不明确。Th17和Treg细胞是新近发现的C D4十T淋巴细胞亚群，目前发现过敏性紫瘫(HSP)中存在Th17细胞及其相关因子IL-6,IL-17和视黄酸相关性孤儿受体(ROR-yt)表达明显增高，而I T'eg及其特异性转录因子叉头蛋白3(Foxp3)表达明显降低2而Thl7/Treg失衡可以被泼尼松等药物调节，但泼尼松作为-种强有效的抗感染药物和免疫抑制剂，其不良反应-也是显而易见的，是否能有某种不良反应较小的药物，也能调节Th17/Treg失衡，改善临床症状呢?槐祀黄是-种真菌提取物，其能调节免疫细胞平衡失调，改善婴幼儿哮喘的临床症状，减少’肾病综合征患儿尿蛋白的排出，促进疾病的恢复6-7是否槐记黄-也能在-定程度上调节HSP1V患儿Th17和Treg及其相关因子的免疫失衡，改善临床症状，目前尚未见相关报道。本研究通过比较HSPN患儿和健康儿童及HSP患儿外周血中Th 17及其相关因子IL-17和Treg细胞水平的差异，观察HSPN患儿体内Th 17/Treg的免疫平衡状况，并且加用槐祀黄治疗HSPN，探讨槐祀黄在调节HSPN患儿Thl7/Treg细胞失衡以及改善患儿临床症状方面的作用。

1资料与方法

1.1-般资料HSP组:2011年7月至2012.年3月在中南大学湘雅二医院就诊的HSP急性期患儿10例，诊断符合2006年欧洲抗风湿病联盟(EULAR)/欧洲儿童抗风湿病学会(PRES)标准7例，女3例;年龄(8.50士2.38)岁;病程(5.30士3.40)do HSPN组:2011年7月至2012年3月在中南大学湘雅二医院就诊的HSPN急性期患儿30例，诊断符合2009年中华医学会儿科学分会制定标准，排除肉眼血尿和24 h蛋白尿>50 m剔kg的患儿。男19例，女11例;年龄(8.87士2.57)岁;病程(5.98士5.03)d}HSP患儿和HSPIV患儿均为初次发病，未使用过糖皮质激素及其他药物治疗健康对照组:2012年3月在中南大学湘雅二医院体检的健康儿童11例。男7例，女4例;年龄(7.09 13.17)岁。3组儿童性别、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.OS),HSP和HSPN患儿在病程[差异无统计学意义(P>0.05)二所做研究均已征得家长同意和医院伦理委员会的批准。

1.2分组将研究对象先分为3组:HSP组、HSPN组和健康对照组，分别检测3组患儿IL-17水平、Th17和CD4'CD=5'Treg细胞数。HSPN组留取尿液检测24 h尿蛋白(邻苯三酚红比色法)和尿沉渣红细胞(离心沉淀法)HSPN组病理检查为11级的20例患儿按随机数字法随机分为常规治疗组和槐祀黄治疗组。将病理检查为}a级的10例患儿按随机数字法随机分为泼尼松治疗组和泼尼松十槐祀黄治疗组。分别子药物治疗2个月后，抽血检测IL-17水平、Th17和CD4 CD25'Treg细胞数，留尿检测24 h尿蛋白和尿沉渣红细胞数

1.3药物干预方法常规治疗组予口服福辛普利5}10 mg/次(12岁以下5 mg,12岁以上10 mg),1次/d，双嗜达莫5 mg/(kg·d),3次//d。槐祀黄治疗组予常规治疗并口服槐祀黄颗粒(启东盖天力药业有限公司，生产批号:AE24)10 g/次，2次/d。泼尼松治疗组予常规治疗并予泼尼松1 mg/(kg·d)，晨起顿服。泼尼松十槐祀黄治疗组予常规治疗、泼尼松和槐祀黄颗粒口服。

1.4 IL-17检测清晨空腹抽取静脉血2.5 mL于无菌肝素钠抗凝管中，1000 r/min离心15 min后吸取上层血清，采用ELISA法(IL-17 ELISA试剂盒由土海百沃生物工程有限公司提供)检测血清IL-17水平。余下约2 mL鲜血用于Th17和Treg细胞的检测。

1.5 Th17细胞检测新鲜的2 mL静脉血用等量的PBS稀释，采用Ficoll密度梯度离心法(使用人淋巴细胞分离液由天津市濒洋生物制品有限责任公司提供)分离外周血单个核细胞，调整细胞浓度至2x10个/L,取2 mL细胞悬液，种植至24孔板(美国Costa:公司)，加人佛波酷(美国Sigma公司)0.1 p,g(质量浓度为0.OS m扩L)，离子霉素(美国Sigma公司),mol(浓度为1 mmol/L)，莫能星(美国Sigma公司)2.8},g(质量浓度为1.4 m别L)。充分混匀后置于37℃，50 mL/L C0}培养箱中培养4-6 h,2500 r/min离心10 min，弃上清，PBS洗涤2次后，加人20}L PE标记的鼠抗人C D4抗体(美国Biolegend公司)。室温避光孵育30 minoPBS洗涤2次，固定液(韩国Biosharp公司)室温避光固定20 min后，3000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次，加人破膜剂(韩国Biosharp公司)室温避光孵育20 min后，3000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次后，等分为2管，分别加人20},L FITC-IL17美国Biolegend公司)和同型对-照抗体PE-IgGl(美国Biolegend公司)，室温避光孵育30 min,3000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次，0.3 mL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测。

1.6 Treg细胞检测取2 x 10}个/L单个核细胞分别加人2个EP管中，I管为试验管，1管为阴性对照管，每管0.5 mL，试验管加20 O,L PE-CD4美国Biole-Bend公司)和20},L FITC-CD};(美国Biolegend公司)，阴性对照管加人同型对照抗体PE-IgGl美国Biolegend公司)，室温F避光孵育30 min,3000 r/min离心5 min,PBS洗涤2次，0.3 mL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行处理，计量资料以无土、表示，方差齐采用单因素方差分析，方差不齐采用Kruskal-IX}alLis H检验整体均数差异，Nemeuyi检验两两均数差异，配对资料采用配对样本t检验，两样本均数比较采用独立样本t检验。P<0.OS为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组患儿IL-17,Th17和Treg比较HSP组和HSPN组患儿外周血中Th17细胞数及其相关因子IL-17水平均较健康对照组明显增高(P均<0.OS),Treg细胞水平较健康对照组明显降低(P<0.05)，但HSPN组患儿Th17,Treg细胞数和IL-17水平与HSP组患儿比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1，图1、2。

2.2常规治疗组和槐祀黄治疗组患儿治疗前后IL-17,Th17和Treg及尿沉渣、尿蛋白比较常规治疗组治疗后Th17细胞数、IL-17水平、尿沉渣红细胞较治疗前有所下降，Treg细胞数较治疗前有所升高，但差异均无统计学意义(P均>0.OS);24 h尿蛋白较治疗前明显下降(P<0.OS)。槐祀黄治疗组治疗后Thl7细胞数、IL-17水平、24 h尿蛋白、尿沉渣红细胞较治疗前和常规治疗组明显下降(P<0.05)，而Treg细胞数较治疗前和常规治疗组明显增高(P<0.05)，见表2-4.

2.3泼尼松治疗组和泼尼松+槐祀黄治疗组患儿治疗前后IL-17,Th17和Treg及尿沉渣、尿蛋白比较泼尼松治疗组治疗后Th17细胞数、IL-17水平、24 h尿蛋白、尿沉渣红细胞均较治疗前明显下降(尸均<0.OS)，而Treg细胞数较治疗前明显增高(P<0.05)0泼尼松+槐祀黄治疗组治疗后Th17细胞数、1L-17水平、24 h尿蛋白、尿沉渣红细胞均较治疗前均明显下降(P均<0.05)，而Treg细胞数较治疗前明显增高(P<0.05)0泼尼松治疗组与泼尼松+槐祀黄治疗组治疗后Th17,Treg细胞数、IL-17水平、24 h尿蛋白、尿沉渣红细胞比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表5-7 

3讨论

HSP累及肾脏时称为HSPN，其是儿科最常见的继发性肾小球疾病之-。HSPN在HSP中的发病率为30%-50%，对HSP患者进行肾活检发现90%以上的患者均有不同程度的肾损伤，肾功能的损害程度影响HSP的预后。但目前对HSPN的发病机制尚不十分清楚，可能与细胞免疫失衡有关 Th17和Treg是近几年才发现的CD4十T淋巴细胞亚群，它们在维持机体免疫平衡过程中发挥重要作用，免疫相关性疾病和感染性疾病中均广泛存在Th17/Treg细胞平衡失调，表现为Th17细胞增多，C D4十CDzS+Treg细胞减少。本结果显示，HSPN患儿体内存在Th17细胞及其相关因子IL-17水平明显增高，而Treg细胞水平明显下降，提示Th17/Treg免疫失衡可能在HSPN发病机制中起重要作用，而HSP组、HSPN组患儿Th17/Treg的比值无明显差异，提示二者在Th 17/Treg发病机制上无本质差异。

槐祀黄颗粒是由槐耳菌丝体发酵的提取物，配伍中药构祀子、黄精而制成的颗粒剂，槐祀黄的主要有效成分槐耳富含槐耳菌质多糖(PS-T，是由6种单糖组成的杂多糖结合18种氨基酸构成的蛋白质，是活性很强的生物反应调节剂，能激发机体免疫系统中诸多环节，从而调节免疫细胞的平衡失调。本实验发现槐祀黄颗粒联合常规治疗能显著下调HSP患儿和HSPN 11级患儿Th17细胞及其相关因子IL-17水平，上调Treg细胞表达，提示槐祀黄在调节IISP患儿和HSPN II级患儿体内Th17/Treg的免疫平衡方面有明显的疗效。槐祀黄治疗组较常规治疗组能更明显降低24 h蛋白尿和尿沉渣红细胞水平，提示槐祀黄能进-步改善HSP患儿和HSPN II级患儿临床症状。泼尼松+槐祀黄治疗组能明显下调HSPN III级患儿Th17,IL-17水平，上调Treg细胞表达，并且明显降低24 h蛋白尿和尿沉渣红细胞水平。但与泼尼松治疗组相比，二者并无统计学差异。泼尼松具有强大的抗感染和抑制免疫作用，其对T淋巴细胞亚群同样具有明显的调节作用。

研究发现，SLE患者使用泼尼松治疗后，外周血Treg细胞的数量较治疗前出现明显上升，而且高于未使用泼尼松治疗的患者，提示泼尼松能有效诱导Treg细胞增殖。巨细胞动脉炎外周血中Th17细胞水平是健康人群的8倍左右，使用泼尼松治疗2个月后，1h17细胞的表达几乎降至健康人水平，其相关的细胞因子1L-1压IL-17和IL-23的表达也明显受到抑制;颗动脉病理检查显不Thl7在病变血管中有明显的表达，经泼尼松治疗后，重复活检发现1'h 17的表达儿乎无法测出，提示泼尼松在抑制'Th 17细胞的表达方面发挥显著效应所以本研究推断泼尼松十槐祀黄治疗组与泼尼松治疗组比较无统计学差异的原因可能是由于泼尼松强有力的抑制Th17细胞功能，并且显著促进Treg细胞增殖，从而使得槐祀黄的作用表现不明显。综上，HSPN患儿体内存在明显的Th17细胞及其相关因子IL-17水平的增高和Trek细胞表达的降低。槐祀黄作为-种新型的免疫调节剂，能在-定程度卜下调Th17细胞数和IL-17水平，上调Treg细胞的表达，减轻患儿的血尿和蛋白尿，改善患儿临床症状。

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