广东地区原发性激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2、CD2AP基因突变筛查

原发性肾病综合征(PNS)患儿中约20%对激素治疗不敏感，称激素耐药型肾病综合征(SRNS)，且大部分逐渐进展到终末期肾病(ESRD)。目前，原发性SRNS的耐药机制尚未明确，但越来越多的研究证实基因变异参与了其发病机制，其中VPHS2和CD2AP基因突变在部分SRNS患儿中曾有报道，认为这2个基因突变可能与散发性SRNS发病易感性相关，但前者的突变率与SRNS发病的相关性存在地区和种族差异，而联合筛查二者的变异情况与SRNS发病的研究国内尚不多见，因此本研究对26例原发性SRNS患儿进行NPHS2和CD2AP基因变异检测，旨在了解中国广东地区原发性SRNS患儿中2个基因突变的分布特征，并进-步研究SRNS患儿中2个基因变异是否关联，以助于原发性SRNS的临床诊断与治疗。

1资料与方法

1.1-般资料(1)健康对照组:选自2006年1月至2012年12月广州市第-人民医院儿科体检健康且实验室检查正常者20例。男11例，女9例。汉族，无肾病病史和肾病家族史。平均年龄4.8岁帕个月-13岁)。(2)SRNS组:选择同期临床诊断为原发性SRNS}'-，经每日激素1.5-2.0 m到(kg}d)治疗4周仍有持续蛋白尿的NS患儿26例。男18例，女8例。汉族，来自不同家族，无肾病家族史，排除先天性NS(出生后3个月内出现的NS)和继发性NS。符合标准的SRNS患儿来自广州市第-人民医院、广州市妇女儿童医疗中心，广东省粤北人民医院，随访时间为4}60个月(平均22个月)。平均发病年龄5.5岁(8个月-14岁)。以上2组儿童籍贯均为广东，均为原籍出生。本研究经3所医疗机构伦理委员会批准，均由患儿家属签署知情同意书。

1.2基因变异分析

1.2.1基因组DNA提取:采用盐析法从外周血白细胞中提取基因组DNA。所有受试者禁食12 h后清晨空腹采集静脉血2-4 mL，立即收集于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中混匀后，高盐法抽提外周血单核细胞(PBMC)基因组DNA。采用分光光度计测定DNA的浓度，并用琼脂糖凝胶检测其完整性。

1.2.2引物设计(1)NPHS2:应用引物设计软件Primer 5设计扩增外显子1的引物。扩增外显子2-8采用Tsukaguchi等设计的引物。引物序列见表la(2)CD2AP:从美国国立生物技术信息中心(NCBI)Nucleotide数据库获得的基因组序列(NT_000006)，采用潘晓霞等rs·设计的引物扩增外显子1-18引物序列见表20

1.2.3 PCR反应体系和条件25 p,L PCR反应体系中，加人基因组DNA 50 ng,5 pmol/L正、反向引物各1 p,L,2 x Taq platinum PCR masterMix 12.5 N.,L(Qia-gen，Germany)及ddHZ 0 9.5 N.,L 0 Touchdown PCR反应条件为:94℃预变性5 min后，94℃变性30 s,54-68 0C(C D2 AP为55-60℃)退火30 s,72 0G延伸45 s,循环36-38次，最终以72℃延伸7 min(Biometra UNO II型扩增仪，德国)。VPHS2和CD2AP的外显子1因GC含量高，PCR反应体系中使用LA Taq高保真耐热DNA聚合酶和2 x GC Buffer II(TaKaRa，日本)进行扩增。

1.2.4 DNA序列测定PCR产物经纯化后以正、反向引物为测序引物应用ABI PRISM 3730测序仪(上海英骏生物技术有限公司)进行序列测定，用NCBI Blast在线软件(http;//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行序列比对，当结果显示变异时加测互补链以明确变异存在。

1.3统计学处理用SPSS 13.0软件对2组基因型和基因频率进行X检验，所有数据用、士、或百分数表示，基因型和基因频率采用直接计数法，P<0.OS为差异有统计学意义

2结果

2.1基因变异结果对所有受试儿童进行DNA测序分析，并未发现VPHS2基因突变，在14例SRNS患儿和4例健康对照组儿童中检测出VPHS2基因的3个单核昔酸多态性(SNP)，分别为288C>T,954T>C和1038A>G，均为已报道的不引起氨基酸序列改变的SNP，见图1。在26例SRNS患儿中288C>T的等位基因频率(C/T)分别为0.93,0.07;954T>C的等位基因频率(T/C)分iii!为0.80,0.20;1038A>G的等位基因频率(A/G)分别为0.90,0.10,2组间各SNP的基因频率和基因型比较差异均无统计学意义(尸均>0.OS)，且检测出SNPs的患儿与未检出SNP、的患儿其临床特征差异亦无统计学意义(P>0.05)二2例SRNS患儿检测出CD2AP基因1个内含子区突变(1917+20 C>G)，见图2。此外未发现CD2AP基因外显子的突变和SNP，健康对照组儿童未发现任何基因变异。

2.2临床资料随访过程中,26例患儿平均发病年龄为5.5岁(8个月-14岁)。14例检出、PHS2 SNP的SRNS患儿中，共有10例患儿接受肾穿刺活检，7例患儿表现为局灶节段性肾小球硬化(ESGS)，且临床表现均为反复出现大量蛋白尿，其中2例因治疗效果不佳进展为ESRD而死亡;2例患儿表现为微小病变型肾病(MCD)，经治疗后达到完全缓解;1例患儿表现为系膜增殖性肾小球肾炎(MsPGN)，接受泼尼松+ESRD治疗后，仍表现为反复大量蛋白尿。其余12例未检测出VPHS2 SNP的患儿有7例接受肾穿刺活检，其中3例表现为MsPGN,接受泼尼松+环饱素(其中2例经环抱素治疗效果不明显者，加用他克莫司)治疗后达到缓解。4例患儿表现为FSGS，因治疗效果不佳进展为ESRD，其中有1例患儿接受肾移植0.5年后再次出现SRNS}2例检测出CD2AP内含子突变的患儿均为男性，发病年龄分别为11个月和19个月，肾穿刺病理显示均为FSGS，复发2次后经环磷酞胺冲击和小剂量激素治疗后目前均维持缓解.肾功能正常)

3讨论

目前多国学者已发现超过30种NPHS2的基因突变，证实了部分突变可能通过影响其编码产物肾小球裂孔隔膜(SD)区podocin蛋白表达下降，使肾小球足细胞内信号转导功能发生障碍，肾小球足细胞减少，SD结构与屏障功能的完整性破坏，肾小球蛋白滤过增加。于磊和刘国平“研究发现%'}%PHS2基因C(-601)T-G357T单倍型对临床IgA肾病的发生及严重程度具有重要作用。Sheila等对110例SRNS进行了基因变异研究，发现、PHSI和VPHS2为常见突变基囚，VPHS2突变患儿更易发展成为ESRD。这些基因突变患者在肾脏移植后均未出现复发。可见:1'PHS2变异研究最重要的意义在于对临床治疗的指导作用，对免疫抑制剂疗效和FSGS患儿肾移植后复发的预测作用。但由于、PHS2基因变异类型和频率存在地域和种族差异，其在亚洲国家并不常见}7 Yu等曾对23例散发性SRNS患儿进行了VPHS2基因突变分析，首次证实了中国儿童散发性SRNS存在VPHS2基囚突变，突变发生率为4.3%，提示我国散发性SRNS患儿，也要考虑有VPH S2突变的可能与之不同的是，本研究对26例中国广东地区的SRNS患儿进行NPHS2基因变异检测，但均未检测出VPHS2基因突变，仅在14例患儿和4名健康对照组儿童检测到外显子2和外显子8上的3个SNP，但2组间差异无统计学意义。

而目前认为与肾小球病变密切相关的8229 Q变异川在本研究中并未发现，提示NPHS2基因变异可能并非广东地区SRNS患儿激素耐药的主要}L制。通过对-患儿临床资料进行分析，尚不能认为检出NPHS2 SNP的患儿与未检出NPHS2 NSP的患儿其病理改变及治疗效果存在差异。CD2AP基因的编码蛋白CD2AP是另-个重要的足细胞SD分子，对维持足细胞SD结构和功能的完整性具有重要作用。史秀岩等研究发现PNS患者肾小球足细胞中CD2AP表达降低，且在MCD和FSGS中与足细胞病变程度相关。CD2AP基因突变与肾脏疾病的发生密切相关。CD2AP基因突变导致常染色体隐性遗传型或常染色体显性遗传型SRNS}。Lbwik等在20例荷兰散发性SRNS患儿中发现1例存在CD2AP基因纯合突变，1例存在CD2AP基因杂合突变(该患儿同时还存在1个、PHS2基因杂合突变)，突变检出率为10%孟大川等分析40例中国汉族散发性SRNS患儿CD2AP基因变异情况，在3例患儿中检测出3种基因变异IVS7-1356>A,1083T>C和IVS13-1376>A，其中前-种为非致病突变，后2种突变的致病性不明确。潘晓霞等在82例中国12}76岁的散发性FSGS患者中发现2例存在CD2AP基因杂合突变，突变检出率为2.440I.封东宁等oz在30例SRNS患儿中，发现2例携带CD2A1'基因单杂合突变，分}!l为IVS13-1376>A，IVS7-1356>A,13enoit等在42例法国隐性遗传型SRNS患儿中未检测出CD2AP基因致病突变，提示CD2AP基因突变不是法国SRNS儿童的主要致病原因。

可见，CD2AP基因突变可能并非中国家族性肾脏疾病的主要原因另-方面，有研究发现podocin C端富含脯氨酸残基是蛋白与蛋自相互作用的重要部位，podocin}aJ通过其G端与足细胞裂孔膜的又-重要分子CD2.}P蛋白的胞内端相互作用，二者再与足细胞另-分子nephrin在SD中相互连接，形成复合体来参与足细胞的滤过屏障的稳定性和信号传递李秋月等研究发现糖尿病肾病大鼠足细胞podocin,CD2 AP表达异常，通过增加podocin,CD2AY表达起到保护肾脏的作用)Lhwil}等Ln在-项患儿多基因变异联合筛查研究中发现1例患儿存在VPHS2和GD2AP基因同时突变该患儿的VPHS2基因6226>A杂合突变使podocin第208位丙氨酸被苏氨酸替代(A208T)，改变了podocin的结构，致使podocin与CD2AP的相互连接发生异常，而CD2AP基因杂合突变增加了、PH.S2基因杂合突变的效应，产生互补作用而导致SRNS的发生。孟大川等11在40例中国汉族散发性SPANS患儿中检测到1例CD2AP杂合突变合并、PHS2杂合突变的患儿，该患儿在5个月时诊断为SRNS，肾脏病理为FSGS，应用足量激素治疗6周后尿蛋自末转阴(+++)

二  2例患儿的临床病理特征相似，故认为CD2AP突变同时伴有、PHS2基因突变可能增加患儿发展为FSGS的易感性。为探索广东地区SRNS患儿中这2个基因变异是否关联，本研究还对CD2AP基因进行研究。结果并未发现CD2AP基因的外显子突变或SNP，以往研究报道可能与蛋白尿相关的突变，如14886>A和18340>T亦未检测到。

本研究发现CD2AP在其18号外显子下游20 by的内含子序列中发现-杂合突变(1917+200>C)，分析携带此突变的2例患儿临床资料，其发病年龄均偏小(分别为11个月和19个月)，且肾朋病理均为FSCS，其余临床特征与无突变患儿并无差异，提示在广东地区SRNS患儿中，CD2AP基因突变可能与早发的SRNS患儿发病有关，且肾脏病理可能更易倾向于FSCS表现，但尚待在多中心大样本研究中进-步予以验证J急之，本研究在26例原发性SRNS患儿中未检测出、PHS2基因突变，提示.'}PHS2基因变异并非中国)、-东地区儿童SRNS的病因之-。而CD2AP基因外显子也未检测出突变和SNP，虽然有2例患儿携带了内含子突变，尚不足以证明CD2AP基因突变与原发性SRNS患儿相关，但CD2AP基因内含子突变是否可以增加患儿对早发性SRNS和FSGS的易患性还需在下-步的多中心大样本筛查中进-步论证二者间的关系。由于本研究例数较少，未发现VPHS2和CD2AP二者基因均突变的患儿，需要进-步研究发现基因变异与肾脏疾病的关系。