全反式维A酸对缺氧性肾小管上皮细胞Prohibitin1和Prohibitin2表达的影响

抗增殖蛋白Prohibitin(PHB)是-种肿瘤抑制蛋白，具有抗细胞增殖和抗肿瘤作用个亚型。研究发现，全反式维[‘〕，包括PHB 1和PHB2 2 A酸(ATRA)可能通过增加单侧输尿管梗}3}(UUO)大鼠肾脏组织PHB的蛋白及其mRNA表达，减少肾脏组织转化生长因子(TGE-(31)的蛋白及其mRNA表达，从而达到抑制肾间质纤维化(RIE)慢性进展的作用u-。然而，ATRA对体外培养的肾小管上皮细胞PHB 1和PHB2表达的影响如何目前尚不清楚。因此，本研究应用实时荧光定量(RT)-PCR和Western blot分别检测ATR,a干预后的缺氧性肾小管仁皮细胞(RTEC)PHBI,PHB2的mRNA和蛋白表达水平，探讨ATRA对缺氧性R'I'EC PI}B表达的影响

1材料与方法

1.1模型制作及分组大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK-52E购自卜海生物细胞库)采用混有胎牛血清和双抗的培养基(100 mL培养基中加5 mL胎牛血清和1 mI双抗)在37℃,50 mL/L二氧化碳(C0,)培养箱中培养并传代后种于6孔板中，每孔1 x1护个细胞，建立正常组，缺氧24 h及36 h的模型组、ATRA干预组:正常组不做任何处理。模型组的造模参考文献[3]，将6孔板放人真空罐中，罐内壁用750 mL/L乙醇擦洗，密闭盖后，通道接真空泵开始抽气至容器内压力为26.6 kPa，通人无氧气体(950 mL/L氮气和50 mL/L COZ)平衡至101.8 kPa后密闭通气口、若反复抽气-充气多于5次，则容器内气体体积分数接近通人气体体积分数。将真空罐放人培养箱中，复氧时取出6孔板打开盖子置于37℃培养箱中30 min，使其氧分压恢复正常。ATRA干预组在6孔板中加人浓度为0.1 N,mol/L ATRA(参照文献[4]，经测试0.5},},mol/L,1.0}.,mol/L,5.0 N,mol/L、10.0}.},mol/L,50.0}A,mol/L、100.0 N.,mol/L ATRA对细胞损伤较大，最终确定选用。.1 N,mol/L)后参照模}}J组的方法缺氧及复氧。

1.2 RT-PCR法检测NRK-52E细胞PHBl,PHB2,TGF-田mRNA表达引物均由上海生物工程公司生产，引物序列见表1。总RNA的提取及RT-PC R:分别于造模24 h,36 h按RNA提取试剂盒提取各模型组的总RNA。为减少误差，每个时间点重复3次。用紫外分光光度计测RNA的浓度并用电泳测得RNA的完整性和降解情况。按反转录试剂盒说明进行反转录，然后进行RT-PCR。反应体系(总体系20.0},L);cDNA 0.6},L、上-F游引物各0.3},L、荧光mix 9}a,L重蒸水(ddH,0)9.8},L。反应条件:(1)PHB1及PHB2为95℃预变性10 min,95 0C变性15 s,62 0C退火30*，68℃延伸30 s,40个循环。(2)TGF-甲为95℃预变性10 min,95 0C变性15 s,58 0C退火15 s,68 0C延伸30 s，40个循环。每个样本重复3次，取其平均值为样本Ct值。用2-“}a法进行mRNA相对表达量的比较5。

1.3 Western blot法检测NRK-52E细胞PHBl,PHB2蛋白表达分别于造模24玩36 h按放射免疫沉淀测定(RIPA)蛋白裂解液说明书提取各模型组总蛋自，并用二喳琳甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。总蛋自变性后进行Western bloto每孔上样50},T_，-卜二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至0.22},},m聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)封闭液摇床封闭2h，洗膜缓冲液洗3次，每次10 min,将PVDF膜分别放人PHB 1,PHB2,TGF-团兔源单克隆抗体(1:1000)缓冲液中，4℃冰箱孵育过夜，加人荧光标记的羊抗兔1gG(1:5000)，室温摇床孵育1 h,洗膜缓冲液洗3次，扫描PVDF膜分析。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析，数据用x士、表示，组间比较采用完全随机方差分析，SNK法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1正常组、模型组、ATRA干预组NRK-52 E细胞PHBl,PHB2,TGF-份的mRNA表达与正常组比较，缺氧24 h和36 h时，模型组和ATRA干预组NRK-52E细胞PHB 1和PHB2的mRNA表达量显著降低，缺氧时间越长，表达量越低，而A I'RA干预组NRK-52E细胞PHBI,PHB2的mRNA表达量显著高于模型组NRK-52E细胞PHBI,PHB2的mRNA表达量。模型组和ATRA干预组2个时间点NRK-52E细胞TGF-田的mRNA表达量显著高于正常组，缺氧时间越长，表达量越高，而ATRA干顶组NRK-52E细胞TGF-田的mRNA表达量显著低于模型组的表达量，见表2-4，图1-3,

2.2正常组、模型组、ATRA干预组NRK-52E细胞PHBl,PHB2,TGF-份的蛋白表达与正常组比较，缺氧24 h和36 h时，模型组和ATRA干顶组NRK-52E细胞PHB 1和PHB2的蛋白表达量显著低于正常组，时间越长，表达量越低，而ATRA干预组NRK-52E细胞PHBI,PHB2的蛋白表达量显著高于模型组。模型组和ATRA干预组2个时间点NRK-52E细胞FGF-团蛋白表达量显著高于正常组，缺氧时间越长，表达量越高，而ATRA干顶组NRK-52E细胞的蛋白表达量显著低于模型组，见表5-7，图40 

3讨论

Prohibitin基因于1989年由McClung等首先从哺乳动物体内克隆出，PHB基因的表达产物PHB蛋白是-类新型分子伴侣蛋白，其氨基酸结构非常保守，具有抗肿瘤、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡等作用。有研究显示，在胃癌组织中PHB蛋白及其mRN}均过度表抹.可能与肿瘤的发牛发展有密切的关系。体内实验发现，PHB存在于肾小管和间质细胞中，与肾小管间质损伤程度相关，体外研究表明，PHB可能通过非Small、信号通路而抑制T(}F-田诱导的成纤维细胞增生活化和产生细胞外基质i8:。史雨等L}〕通过研究肾脏疾病患儿血PHB表达发现，患儿血PHB表达明显升高，且血PHB水平与肾小球及肾小管间质损伤程度明显相关。本课题组前期研究显示，UUO大鼠肾脏组织PHB表达量明显下降6es，体外实验中，转染外源性PHB 1和PHB2可抑制缺氧性RTEC(NRK-52E细胞)的表型转化，造模缺氧12 h,24 h,36 h RTEC的PHBl和PHB2 mRNA表达量和蛋白表达量明显下降，且缺氧时间越长损伤越明显。本研究结果显示，在缺氧24 h,36 h时，RTEC的PHB 1和PHB2的mRNA表达量和蛋白表达量均明显下降，缺氧时间越长，表达量越低，与之前的报道结果相符ATRA是y'itA的代谢物，参与了包括细胞增殖与分化的生物过程,ATRA有免疫调节和抗感染的作用，同时ATRA可抑制炎性细胞如TNF-a,IL-1(3和IL-6在不同细胞中的表达。有研究显T,ATRA能有效防止辐射诱导的肺纤维化，在大鼠体内，治疗剂量的ATRA能有效减少抗基底膜抗体肾小球肾炎的尿蛋白量，具有保护肾脏的作用。

陈幼发通过观察4周、8周1型糖尿病大鼠肾脏病理改变，免疫组织化学方法检测肾小管-间质Prohibitin的表达，显示ATR,}通过上调肾小管-间质Prohibitin的表达而减轻R工F Zhou等‘s报道在UUO大鼠中，A1'RA干预的大鼠肾组织PHB的mRNA表达量明显上调，可能通过增强肾脏组织PHB的表达而减轻RIF以上研究提示，ATRA对肾病大鼠肾脏组织具有保护作用，可明显减轻RIF然而，ATRA对体外培养的RTEC PHB的影响如何?目前国内外尚未见报道。本实验结果显示，0.1}a,mol/L的ATRA能显著增高缺氧性RTEC PHB1和PHB2的mRNA表达及其蛋白表达，同时下调TGF-团的mRNA表达及其蛋白表达。因此，推测ATRA对缺氧性RTEC损伤可能具有保护作用，但确切的作用机制及其信号通路尚不清楚，有待进-步探讨。