microRNA在脓毒症患儿线粒体功能障碍的研究进展

脓毒症是机体对病原微生物感染引起的全身炎性反应,进一步发展可致多器官功能障碍综合征(MODS),涉及细胞内多条信号转导通路的活化和分子机制。线粒体是细胞中重要的细胞器,通过氧化磷酸化反应为机体提供ATP,调控细胞信号转导、细胞凋亡和基因表达等,对机体生长、代谢、疾病的发生发展等多方面都有重要意义[1]。近年来,大量研究表明线粒体是脓毒症时损伤的主要靶细胞器[2],线粒体损伤可导致机体利用氧的能力下降,ATP生成减少,细胞供能不足,终致各脏器功能衰竭,其损伤和衰竭程度与脓毒症的预后密切相关。microRNA(miRNA)主要通过调控线粒体的呼吸作用和氧代谢过程对线粒体形态及功能产生影响,其表达水平与线粒体形态和功能密切相关,并可对线粒体相关基因进行调节,影响线粒体的能量代谢、氧化磷酸化及动力学等,进而影响细胞功能。现对miRNA在脓毒症线粒体功能障碍的相关研究作一综述,以期提高广大医师对脓毒症线粒体功能障碍的认识水平。

1 miRNA的结构及其生物学功能目前动物体内的miRNA生物合成过程已得到较为详尽的诠释[4]。细胞核内编码miRNA的基因首先在核内由RNA聚合酶Ⅱ转录,生成初级转录产物是长度为100~1000个核苷酸、有帽状结构和多聚腺苷尾巴的初级mRNA(Pli miRNA),然后RNA在核糖核酸内切酶ⅢDr。sha和其辅因子Pasha的作用下被剪切成⒛个核苷酸含茎环结构的前体miRNA(Pre lmiRNA),Prc miRNA在核内小分子GTP结合蛋白(RAN￡TP)和转运蛋白5(expoin5)复合物作用下转送到细胞质后,再由另一类核糖核酸内切酶ⅢDiccr将其进一步剪切为21~Ⅱ个核苷酸的成熟双链miRNA。这些成熟的双链miRNA其中一条链A吃onautc1蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induccd趾encing comp1ex,RISC),此链称为miRNA,另一条链称为miRNA来[51,RIsc通过与靶纂因mRNA核酸序列互补结合发挥作用。miRNA基因在基因组中主要有单拷贝、多拷贝和基因簇3种存在形式,多定位于基因间隔区,转录不依赖其他基因,不翻译成蛋白质,仅对生物体基因活动(生长、分化、凋亡及应激反应等)的各个层面进行调节[6]。近来有人把he~mlRNA分为5部分:5m。Rs,而RNA斗,茎环结构,llalRNA,3moRs[7闷l。miRNA的5端是高度保守的,茎部的保守性更强,而环部可能存在一些突变位点,这有利于确保各物种间高度钓进化保守性以及稳定性,使其在生命活动中不易被降解。mlRNA还具有组织表达特异性和空间时序表达特异性等生物学特性[9]。其生物学功能主要是调节转录后生物蛋白质的表达水平[l0],通过以下2种机制:(1)与靶基因mRNA3端非翻译区(3UTh)结合,抑制靶基因翻译和表达;(2)结合并降解靶mRNA。近来有研究表明,mlRNA还可以上调靶基因蛋白的表达水平,而不仅仅是阻遏作用[l1]。

2脓毒症中线粒体功能障碍的机制有学者提出脓毒症与微循环和线粒体功能密切相关,微循环障碍和线粒体损伤互为囚果,在脓毒症进一步发展为MODS的过程中共同发挥作用,因此探讨脓毒症中线粒体损伤发病机制有重要意义。其主要机制为以下几个方面。

2.1氧化应激脓毒症时由于微循环障碍和脏器内微血栓形成,机体组织细胞呈持续缺氧缺血状态,呼吸链发生不可逆改变。Navdl和Bclves[1]对离体线粒体的研究表明,当呼吸链活性降低、机体应激反应或疾病状态下线粒体呼吸链损伤时,呼吸链复合体I或Ⅲ过程中的“电子漏”使氧与单电子直接结合生成和H202,导致活性氧自由基(ROS)生成量增加,引起细胞氧化损伤。此时线粒体内一氧化氮(NO)产生增多,细胞色素氧化酶C和辅酶Q的活性直接受抑制,影响线粒体氧化磷酸化过程,单胺氧化酶活性受抑,降低线粒体膜的流动性[13]。

2.2炎症应答内毒素可激活大量炎性介质,如中性粒细胞,淋巴细胞和单核细胞系统产生“口乎吸爆发”,释放更多炎性介质;激活钙依赖蛋白性蛋白激酶,形成黄嘌呤氧化酶;促进诱导性NO合酶的合成,使机体产生大量ROs,抑制线粒体膜蛋白及酶的功能,破坏线粒体膜的完整性;对线粒体DNA(llltDNA)等造成氧化损伤。均使线粒体呼吸氧耗增加,阻断电子转移链中的电子传递作用。炎性介质如TN⒎α和IL-1β可促进线粒体通透性转化,增加细胞凋亡。而线粒体通透性转化可促进线粒体自噬作用,改变线粒体膜两侧质子电化学梯度,从而损伤线粒体功能并产生氧自由基。

2.3钙超载细胞胞质Ca2+浓度升高可导致线粒体摄取和集聚大量的Ca2+,当超出线粒体自身承受限度时形成“钙超载”,使线粒体通透性转换孔呈高通透状态,线粒体肿胀破坏呈不可逆性损害。线粒体破坏使细胞失去能量来源,生命活动无法正常进行;线粒体内细胞色素C释人胞质,激活Casp灬e3诱发细胞凋亡;C+释入胞质,激活胞质内钙依赖性磷脂酶,蛋白酶及核酸内切酶,引起细胞膜损伤,细胞内酶和DNA水解,阻断细胞体自我修复过程。%2+还可以激活NO合酶[ls],增加NO和ROs的生成,是诱发整个细胞死亡的重要因素[1b]。

2.4 DNA损伤及凋亡脓毒症时,自由基增多,ATP合成减少,钙超载等都可直接或间接损伤mtDNA,影响呼吸链复合体活性,使线粒体呼吸功能障碍,细胞中mtDNA的耗竭与脓毒症严重程度呈正相关。内毒素也可通过TNF受体,转化生长因子受体等通路启动凋亡信号,使线粒体通透性转换孔呈高通透状态,线粒体肿胀而终致凋亡。

3 mRNA对线粒体功能障碍的调节

3.1 miRNA对线粒体氧化应激的调节作用mlRNA的表达与线粒体形态、功能有一定相关性,它可通过调节线粒体的相关脂质和蛋白质来影响线粒体的氧化磷酸化、ATP生成等能量代谢过程。特异存在于线粒体内膜上的心磷脂(ca油。hpin,CL)参与氧化磷酸化复合体形成,细胞ATP生成和线粒体生物力能,对细胞氧化极为敏感。长时间细胞缺氧缺血时,线粒体呼吸链产生的ROS增多,细胞色素C/心磷脂复合体形成增多,催化细胞色素C的过氧化作用,致使心磷脂显著减少,终致线粒体的功能损害。肝组织中特异性表达的miRNA-122与线粒体的能量代谢也有密切关系。有实验利用生物信息学分析预测miRNA靶点,通过基因实验和miRNA过表达后检测相关基因表达水平及下游的功能试验,验证了线粒体相关的靶基因如GNPDA1、CHSW、GNPAT等代谢相关酶与miRNA-122呈正相关[19]。说明miRN22的表达增多会在一定程度上减少CL的含量,使线粒体的功能和结构发生改变,破坏细胞和组织的结构稳定性。同样位于线粒体内膜的还有硫酸铁集落蛋白,通过聚集线粒体内的硫酸铁参与电子传递和氧化还原反应。近来有研究发现BCU1/2为低氧条件下线粒体呼吸抑制作用的直接靶点,促进铁硫簇的聚集,是很重要的电子传递和线粒体氧化还原反应的辅基,参与构成线粒体呼吸作用的酶,通过三羧酸循环及电子传递链上的呼吸酶链复合体来抑制线粒体的活性氧系统,以保证细胞正常功能。在体内,mlRNA-210的表达上调或BCU活性受抑制,都会破坏硫酸铁蛋白的完整性。反之,低氧条件下抑制BCU的活性,miRNA210也会调控呼吸酶复合体I和顺乌头酸酶的活性,上调糖酵解减少细胞需氧量来降低线粒体的代谢活动,提高细胞存活[22]。有研究已确定,血RNA-210是缺氧特异性miRNA,低氧条件下,低氧诱导因子1α调节miRNA-210的表达,抑制s CU2,降低硫酸铁蛋白的生成,促进细胞进人细胞周期并阻碍细胞凋亡,以此提高细胞生存率。

3.2 miRrqA对炎症和免疫应答的调节作用脓毒症早期,机体在内毒素刺激下即可释放大量促炎性介质如TN△α、IL-1、1L-2、IL-6等,炎性反应过度从而引起全身炎性反应综合征,其中TNF⒑在血和组织中的浓度最高。有实验得出,TNFα可通过改变氧化呼吸链复合体的亚基构型,改变细胞氧化还原状态,增加线粒体内O2、02/H202、ROs和ATP的消耗,导致线粒体损伤[25],且TN的细胞毒作用由线粒体损伤介导。另外ma vati等[26]的实验证实,TN△α可以在细胞色素氧化酶C的水平上抑制氧化磷酸化反应,因此TNα与脓毒症诱导的线粒体功能障碍密切相关。而核转录因子κB(NΙκB)是多种促炎基因转录的必需因子,可促进TNα等炎性因子相关的多种基因转录。Taganov等用基因芯片技术发现经内毒素刺激人单核细胞系后,mlRN146表达明显调,且通过其靶分子人白细胞介素受体相关激酶1(IRAKI)和TNF受体相关因子6(TRA)负向调节内毒素引起的炎性反应。mlRN肛146的负向调节炎性反应使细菌毒素及其分解代谢产物通过MYD88复活途径,激活NF-κB启动炎性反应,促进炎性因子分泌,另外NF-κB可以增加miRNA-1伯的表达,下调IRAK1和TRA“受体蛋白的水平,负向调节炎性反应。研究表明,血RNA-16在炎性细胞中高表达,推测miRNA-16可能有防止炎症瀑布过度反应的作用[29]。且有文献表明,岫RNA可以加速降解多种炎性介质[30]。mlRNI允是目前发现的靶基因最多的miRNA之一,在特异性免疫应答中起调控作用,其可通过产生细胞控制因子调控B淋巴细胞生发中心的形成和免疫反应,调控T淋巴细胞的发育,并促进自身免疫性炎症的发生[31]。基因敲除miRNA-155的小鼠出现生发中心形成障碍和B淋巴细胞、T淋巴细胞及树突细胞功能障碍。而RN肛155在非特异性免疫中也同样发挥作用,脓毒症时,吞噬细胞表面的To11样受体(TLR)直接识别细菌或病毒产生的病原相关分子,激活各途径蛋白激酶活化转录因子如,并上调吞噬细胞的mRNA~155;而免疫调节因子如干扰素,TNF等也可以L调单核巨噬细胞系统的miRN155的表达。血RNA-146在LPS诱导的单核巨噬细胞激活的非特异性免疫及新生儿先天免疫巾起重要作用迎。

3.3 miRNA对mtDNA的调节作用线粒体DNA对发生突变有高度易向性,缺少蛋白的保护和自我修复体系。因此在脓毒症时,线粒体呼吸链产生大量氧白由基,llltDNA易被氧化损伤。新近研究表明,mlRNA可调节mtDNA的甲基化和组蛋白修饰,推测脓毒症时ROS可诱导mtDNA甲基化模式的改变,调节细胞生物功能和能量代谢,但具体机制还需要进一步研究。有研究苜次证实,mlRNA181c在心肌细胞核中编码,胞质中组装后转移至心肌线粒体并靶作用于线粒体基因,终致电子传递链复合体Ⅳ变构和线粒体功能障碍。这都为进一步探索miRNA在脓毒症中对线粒体动力学和线粒体功能障碍的作用奠定了基础。

4总结

与展望虽然脓毒症中miRNA对线粒体的调节的研究已取得了很大的进展,尤其是mRNA R,l线粒体损伤在氧化应激和炎症免疫方面的调节作用。但由于mRNA家族基囚种类繁多,还有很多miRNA在脓毒症中的作用尚未被发现,已发现的miRNA也仅仅是通过使之缺失或过表达推断出其功能和作用,但具体调控机制还有待进一步确定。因此下一步的工作是,探索发现更多miRNA并阐明其靶作用位点和作用机制,确定对脓毒症早期纠正线粒体功能障碍有效的特异性mRNA,促进线粒体功能的恢复,加速脓毒症恢复进程并改善其预后。

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