microRNA-646在脂多糖处理后的A549细胞中的表达及功能分析

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)现在仍是PICU中威胁人类生命的重要原因之一[1]。据统计,美国ARDs病死率为20。0%~50.0%[2],而我国的病死率高达6.9%[3]。虽然ARDS的发病机制尚未完全明了,但ARDs时减少。hmidt等[4]发现在ARDS患者的肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A(sP-A)、SP-B、SP-C、二棕榈酰卵磷脂明显减少,随着ARDS的好转,其表达水平相应增加。予严重ARDS患者SRC治疗后,能明显减轻缺氧情况,减少病死率。近年来研究发现micr。RNA(血RNA)具有广泛的基因调节功能。多种miRNA在同一个细胞中的表达使细胞处在一种内在的mRNA环境中,这个环境控制着成千上万编码基因的mRNA,使各种蛋白的表达处于合适的水平,调控各种关键蛋白质的表达[5]。血RNA机制的研究可能是基因、蛋白水平有关ARDV急性肺损伤发病机制及治疗研究的重要补充[6]。本研究旨在探讨miR~646在脂多糖处理后的A549细胞中的变化,进一步完善ARDS的发病机制,为ARDS的治疗提供新靶点。现报告如下。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞由南方医科大学肿瘤研究所提供,胎牛血清为澳大利亚的盱clone血清,脂多糖购于美国gma公司,鼠抗人SP-A多克隆抗体、兔抗SRC人多克隆抗体购于美国阮nta cmz公司,免疫组织化学试剂盒(sp-oO23、sp-0024)、DAB/H202显色系统购于北京博奥森生物公司,M-MLⅤ反转录试剂盒、SYBR⒍een qPCR试剂盒均购于美国Invitrogen公司。倒置显微镜为日本0LYMPUS公司产品,实时荧光定量PCR仪为ABI PRIsM 7500电泳仪及转膜仪为美国的Ⅱoad品牌产品。

1.2实验分组A549细胞用含有100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养液,置于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养,每天换培养液1次,2,5mL/L的胰蛋白酶消化传代。待细胞生长至70%~20%融合状态时进行实验,每次实验均采用同一代细胞,并用不同批次的细胞重复实验。脂多糖用PBS液溶解成1g/L的母液置-20℃冰箱保存,实验时用RPMI-16绷培养液配成需要的浓度。分组:(1)对照组采用RPMI-1640培养液培养细胞zh镜下观察后进行实验;(2)实验组分别加入终质量浓度为5、10、15mg/L[7]的脂多糖处理以后镜下观察并进行实验。

1.3免疫细胞化学染色法检测A549细胞中sP-A、SP-C的表达水平取对数生长期细胞,将细胞接种于每孔中加入一张55.00000000000001px×55.00000000000001px消毒盖玻片的6孔培养板中,然后按上述分组加药处理培养zh,用PBS液将6孔板中的细胞爬片洗3遍,加人冷乙醇丙酮液(比例1Ⅱ),固定10min,捞片后固定到载玻片上。免疫细胞化学染色采用免疫细胞化学SP法染色,具体操作按试剂盒说明书进行。小鼠抗人SRA多克隆抗体、兔抗人SRC多克隆抗体的工作浓度均为1∶5OO。免疫细胞化学染色结果判定:SP-A、SRC以胞质出现棕黄色颗粒为阳性,每张细胞爬片分别在0LYMPUS显微镜下随机取5个视野,通过I111ageo-PlⅡ分析系统分别检测各组细胞中SP-A、SRC的平均吸光度(A)值。

1.4 Western bIot检测sP-A、sP-C的表达量取对数生长期细胞,然后按上述分组加药处理培养舛h后用PBS冲洗3遍,加人胰蛋白酶消化后将细胞装入EP管中,加人蛋白裂解液冰中裂解30min,13000min离心5血n后吸取上清液进行二辛可酸(BCA)法蛋白定量,加上样缓冲液煮沸10min后准各上样。每组样品取50ug总蛋白加到预制聚丙烯酰胺凝胶后20Ⅴ电泳3h,半干式电转移至硝酸纤维素膜,50g/L脱脂奶粉4℃温封闭过夜,分别加入SRA(1∶200)、SRC(1∶200)、β-actin(1∶500)抗体4℃孵育12h(β-actin为内参),TBST充分洗膜后再分别与过氧化物酶标记的山羊抗鼠(1∶3000)、过氧化物酶标记的山羊抗兔(1∶2000)的瑭G二抗室温孵育1h,TBST充分洗膜,进行增强化学发光法(ECL)显色。曝光后扫描,分别以叩破/β-actin、SP-C/β-actin显影条带灰度值的比值代表sP-A、SRC的表达量。

1.5实时荧光定量PCR检测细胞中的表达量各组取5×106对数生长期细胞,然后按上述分组加药处理培养⒉h后用PBS冲洗3遍,使用TIizd、氯仿等提取出各组细胞的总RNA,取1uL RNA样品100倍稀释,在分光光度计测定各组样晶的九60/A2:0比值,验证RNA的纯度。各取RNA样品1uL,琼脂糖凝胶电泳,80Ⅴ电泳30min,用凝胶成像系统观察总RNA的完整性。使用特异性miR~646及U6RT引物反转录得到cDNA,U6为内参(具体操作按试剂盒说明书进行)。血R-646上游引物5′-ACACTC-CAGCTGGα扒CCAGCTCCCTCTGAG~s,下游弓H勿5′-CT-α咀CTGGTGTCGTGGA-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTC⒍GCACCACA~R′。反应体系:tIlNA(1∶20)5.0uL,上游引物0.5uL,下游引物0.5uL,SYBR⒐een PCR M碱er Mk10uL,H20 4uL,共20uL。反应条件:%℃,5血n;%℃,15s;6℃,15s,32s读取荧光;们个循环。为建立PCR产物的熔解曲线,扩增反应结束后继续从”℃缓慢加热到。每个样本重复3次。反应结束后分析PCR反应曲线,取各组的Ct值。实验组的相对对照组的表达量以Ct表示。

1.6统计学处理采用叩SS13.0软件进行分析。数据采用屁±s表示。多组样本均数间的比较采用单因素方差分析,符合方差齐性检验后使用D进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1脂多糖处理前后A549细胞的形态学变化对照组A549细胞形态为多角形,胞质饱满,有胞质突起,呈贴壁生长,长满时融合成片,无核固缩现象。脂多糖处理以h后,A549细胞形态变圆,体积缩小,胞质变空亮,且胞质内出现大小不等的颗粒。

2.2免疫细胞化学法检测各组A549细胞sP-A、sP-C的表达量实验组脂多糖处理zh后SP-A的表达量较对照组下降,差异有统计学意义(P均<0.05),并呈现药物浓度依赖性。脂多糖处理zh后实验组SP-C的表达量较对照组明显下降,差异有统计学意义(P均<0.O5),其中10mg/L脂多糖处理组最低。结果见表1。

2.3 Western blot检测各组A549细胞sP-A、sP-C的表达量脂多糖处理以h后Western lDlot检测实验组SP-A表达量较对照组均下降,差异有统计学意义,且随脂多糖浓度的增加,sP-A的表达量越低,呈药物浓度依赖性。实验组SP-C的表达量较对照组均下降,差异有统计学意义,10mg/L脂多糖处理组SRC的表达量最低,结果见图l、2。

2.4各组AM9细胞的RNA纯度和完整性纯度检测:取1uL RNA样品100倍稀释,使用Gen。va分光光度计测定各组样品的九60剧),说明制各的RNA较纯,无蛋白质污染。总RNA完整性检测:各取RNA样品1uL,琼脂糖凝胶电泳(80Ⅴ3O min),用凝胶成像系统观察总RNA的5S沮NA,18S lRNA和娲S 1·RNA条带,3条条带完整,证明总RNA抽提比较完整.

2.5实时荧光定量PCR检测各组细胞miR~646的表达量血R-646和U6的扩增动力曲线基本一致,熔解曲线均只有一个单一的峰值,说明实时定量聚合酶链反应过程中无非特异性扩增产物生成。血R-646在对照组的相对表达量为0.95叨±0.Ⅱ00,5mg/L脂多糖处理组的相对表达量为1.b~s19±0.13,10mg/L脂多糖处理组的相对表达量为2.狎62±01320,15mg/L脂多糖处理组的相对表达量为1.42±0.O938。实验组与对照组比较差异均有统计学意义(F=98.9盯,P均<0.01),其中10mg/L组的相对表达量最高。各组miR~646的相对表达量的柱状图见图3。

2.6 miR-646的表达和sP-C的表达的相关性脂多糖处理A549细胞后,血R-646的表达量和叩-C的表达量呈浓度依赖的负相关性(r=o.916,P<0.O5)。

3讨论

ARDs是指脓毒症、多发伤、大量急诊输血、胃肠内容物吸入、溺水、肺挫伤、重症肺炎和药物过量等肺内外疾病侵袭后出现的以肺上皮细胞、肺泡毛细血管损伤和合成减少为主要表现的临床综合征。其临床特征包括呼吸频速和窘迫,进行性低氧血症,Ⅹ线呈现弥散性肺泡浸润。现阶段ARDS的发病机制仍未完全清楚,目前考虑主要为2个方面:(1)多种炎性介质大量释放引起肺泡上皮细胞及肺泡内皮细胞的损伤、肺泡中积聚富含蛋白及中性粒细胞的渗出液,形成透明膜[9]。(2)肺泡Ⅱ型上皮细胞受损使表面活性物质合成减少,成分改变[10]。是由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成的磷脂蛋白复合物,主要成分包括二棕榈酰卵磷脂及肺表面活性相关蛋白。肺表面活性相关蛋白能降低肺泡液-气界表面张力并防止肺泡在呼气末低肺容量所造成的塌陷,增加肺的顺应性从而更好地维持肺的正常呼吸功能。A5细胞为人肺泡Ⅱ型上皮细胞系细胞,能产生各种肺表面活性蛋白,以人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞为模型,通过来源于革兰阴性菌的细胞外膜的脂多糖的处理,发现A549细胞分泌的SP-A、叩-C的量均下降,这和临床的结果一致。进一步分析结果发现随脂多糖浓度的增加,叩△的表达量逐渐减少,呈药物浓度依赖性;SRC的表达量实验组较对照组均下降,10mg/L脂多糖处理组叩-C的表达量最低,对于sP-C,10mg/L是最佳的脂多糖处理质量浓度。这样建立了ARDS的模型,为对ARDS的发生机制、病理生理等方面进一步的研究提供了基础。

miRNA是一类广泛存在于真核生物中的、长21~笏碱基的非编码小分子RNA。在动物体中,其作用机制是以不完全互补的方式和靶基因的3′端非编码区序列相结合,通过抑制蛋白质的翻译发挥其生物学功能,这种调控一般不会影响靶基因mRNA的稳定性。miRNA通过这种作用机制抑制靶基囚的表达,进而在蛋白质的合成、神经细胞的发育、胚胎发生过程中关键蛋白质的表达等方面发挥重要作用。现阶段研究最多的是miRNA和肿瘤、糖尿病、自身免疫性疾病等疾病的关系。血RNA和肺部疾病的关系也越来越受到重视[ll],如miRNA与肺生长发育的关系、雨RNA与肺部感染性疾病的关系[12]、血RNA与肺纤维化的关系[13-14]、血RNA与哮喘的关系[15]、血RNA与ARDV急性肺损伤的关系。本研究通过实时荧光定量PCR验证了miR~646在实验组中的高表达,在不同质量浓度脂多糖处理A~s⒆细胞后,血R-646的表达量逐渐上升,在脂多糖质量浓度为10mg/L时最高,质量浓度为15mg/L时略下降;同样在不同质量浓度脂多糖处理A549细胞后,叩-C的表达逐渐减少,在脂多糖质量浓度为10 mg/L时最低,质量浓度为15mg/L时略上升。结果显示:血R-646的表达与叩-C的表达呈质量浓度依赖的负相关,二者变化基本同步。

通过血Base、TargetScan预测发现miR~646的其中一个靶基因是叩TPC,血R-646和叩-C mRNA3′端非编码区存在大量互补的序列,而弘646可能和SRC mRNA3′端的互补序列结合来抑制SP-C的翻译。在ARDS过程中高表达的miR~646以不完全互补的方式和SRC mRNA3′端非编码区结合,通过抑制SFTPC的翻译进而减少S弘C的分泌,在ARDS过程中发挥其生物学功能。还需要进一步通过病毒载体构建miR~646过表达体或通过反义寡聚核苷酸等基因敲除miR~646的方法进一步来验证,这是本研究组下一步实验的重点。除miR~646外,是否还存在其他的miRNA通过影、的分泌在ARDs时发挥作用,还需要进一步的研究。目前国内外对ARDS的miRNA方面的研究主要集中在miRNA在感染、免疫、肺损伤方面的影响[17],未见miRNA在ARDS中影响蛋白分泌的报道。随着研究的深入,miRNA可能会成为ARDS诊断中的生物学标记及分子学的治疗手段。

参考文献：

[1]董玉斌,曹亚芹,郭秋芬.肺表面活性物质联合机械通气治疗极低出生体质量儿呼吸窘迫综合征50例[J].郑州大学学报(医学版),2011,(03):474-476.

[2]Ando K,Doi T,Moody SY.The effect of comorbidity on the prognosis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome[J].Internal Medicine,2012,(14):1835-1840.

[3]刘春峰.脓毒症与急性呼吸窘迫综合征[J].实用儿科临床杂志,2008,(18):1402-1404.

[4]Schmidt R,Markart P,Ruppert C.Time-dependent changes in pulmonary surfactant function and composition in acute respiratory distress syndrome due to pneumonia or aspiration[J].Respiratory Research,2007.55.

[5]Lim LP,Lau NC,Garrett-Engele P.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs[J].Nature,2005,(7027):769-773.

[6]Zhou T,Garcia JG,Zhang W.Integrating microRNAs into a system biology approach to acute lung injury[J].TRANSLATIONAL RESEARCH,2011,(04):180-190.

[7]吕晶,李娜萍.脂多糖对培养的A549细胞SP-B分泌的影响及其机制[J].临床与实验病理学杂志,2009,(02):183-186.

[8]Wu TT,Chen TL,Loon WS.Lipopolysaccharide stimulates syntheses of toll-like receptor 2 and surfactant protein-A in human alveolar epithelial A549 cells through upregulating phosphorylation of MEK1 and ERK1/2 and sequential activation of NF-kappaB[J].Cytokine,2011,(01):40-47.

[9]Matthay MA,Zemans RL.The acute respiratory distress syndrome:Pathogenesis and treatment[J].Annu Rev Pathol,2011,(02):147-163.

[10]Cortes I,Penuelas O,Esteban A.Acute respiratory distress syndrome:Evaluation and management[J].Minerva Anestesiologica,2012,(03):343-357.