CCAAT/增强子结合蛋白介导的内质网应激参与癫(痫)脑损伤的机制

癫痼脑损伤(EBD)是指癫痼反复发作未得到有效控制或癫痼持续状态(SE)对脑组织造成的损伤。长期、持续的癫痼发作会对脑组织产生严重影响,是引起儿童智力障碍及精神行为异常的重要原因,严重影响患儿今后的生活质量。目前EBD的发病机制仍不十分清楚,因此,研究EBD的发病机制成为一个刻不容缓的问题。已有实验研究证实,细胞凋亡是EBD的主要病理表现形式[1],而癫痼发作后神经细胞凋亡是一个复杂的多因素过程,其发生机制目前尚不清楚,可能与凋亡相关基因表达有关,并受许多内外因素的调节,包括钙超载、自由基损伤等。目前主要是由3条信号转导通路调控细胞凋亡:线粒体通路、死亡受体通路、内质网应激通路。内质网是真核细胞中的细胞器,可调节C+浓度及负责蛋白质转运,任何影响+浓度或者导致蛋白质错误折叠及转运的因素,都可引起内质网应激(ERS),从而引起一系列的细胞内信号转导及异常基因激活。ERS可启动未折叠蛋白反应(UPR)稳定内质网功能[231,克服ERS,保持细胞内稳态。但当ERS持续存在或内质网功能紊乱严重,而UPR不能恢复其平衡状态时,UPR会使细胞以凋亡的方式走向死亡[4]。ERS作为一种新型的细胞凋亡通路,与EBD关系密切。故研究二者之间的关系,是近几年来研究的热点。但ERS在EBD机制中的作用尚不十分清楚,故本研究应用原位细胞凋亡(TUNEL)检测、免疫组织化学、免疫荧光、Westem blot和Real-time PCR(RT-PCR)技术,动态观察大鼠在SE后不同时间点神经元凋亡数目的变化,以及ERS标志物即葡萄糖调节蛋白78(GRPT8)和ERS特异性促凋亡因子即CCAAT/增强子结合蛋白(CH0P)表达的时相改变,为进一步探讨ERs在SE导致的脑损伤机制中的作用提供理论依据。EBD有严重的后果,因此寻找减轻EBD、保护脑细胞的药物或途径成为近年研究热点。有研究发现大鼠经缺血预处理,通过上调ERS蛋白,起到保护组织细胞的作用,使得在随后发生的严重缺血中生存[5]。由此考虑是否可以通过应用药物来进行干预,使神经细胞发生适度的ERS,从而减轻惊厥后神经细胞的损伤呢?为此,本研究应用内质网应激诱导剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)预处理后,再诱导大鼠田,观察内质网应激信号分子的变化,从而从另外一个角度来探讨ERS在EBD中可能的作用机制。

1材料与方法

1.1 SE动物模型的建立和实验分组 SD大鼠(南京医科大学实验动物中心提供)120只,日龄21d,雌雄各半,体质量50-80g,随机分为正常对照组(n=40),SE组(t=40)矛巾2-DG彩U尘莛肜且(SE+DG组,n=40)。采用腹腔注射戊四氮(PTZ,gO mg/吒,用9bc/L盐水稀释成10g/L,腹腔注射)诱导大鼠SE发作,发作开始时的表现按Lad。幼鼠癫痼发作分级标准进行观察记录。0级:无发作;1级:机械性咀嚼;2级:连续性点头;3级:单侧前肢阵挛;3.5级:前肢交替阵挛;4级:双侧前肢阵挛、后退;5级:双侧前肢阵挛、后退、摔倒;6级:狂奔嘶叫;7级:强直发作。SE组和SE+DG组均达到3.5-7.0级发作,呈SE,无发作与死亡者均被剔除。发作1h后每只大鼠均予地西泮(10mg/炖,腹腔注射)以终止发作。SE+DG组大鼠在腹腔内注射戊四氮前1h给予腹腔注射2-DG20mg/炖。正常对照组用与PTZ等体积的9g/L盐水腹腔内注射,1h后亦给予同剂量的地西泮腹腔内注射。各组大鼠的常规培养及饮食条件相同。

1.2标本的取材和制备所有大鼠于最后一次水浴处理后3、6、12、20、48h取材。腹腔注射100g/L水合氯醛麻醉,打开胸腔,经左心室快速灌注9g/L盐水10-30mL,继而以含硐g/L多聚甲醛PBS行前固定,断头取脑后置上述PBS中固定18-20h。液氮速冻脑标本,冷冻冠状切片,切片厚度8um,用于免疫组织化学和TUNEL检测。

1.3 TUNEL染色取各组大鼠脑组织的冷冻切片,经3bC/LH202/甲醇灭活内源性过氧化物酶,依次按照原位细胞凋亡检测试剂盒TUNEL(德国罗氏公司)说明书进行操作,每次操作之后都用0.01mol/L的PBS(pH=7,2-7.4)充分洗涤,经甘油封片后直接在免疫荧光镜下观察。

1.4 Western bIot检测海马组织加入组织裂解液,超声匀浆,12OO01/min离心20min,吸取上清,B1·ad允rd法测定蛋白浓度,取样品(1OO g蛋白)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转人硝酸纤维素膜,封闭,羊抗大鼠GR刀8多克隆抗体(1∶200稀释)杂交过夜,辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗(1∶10稀释)37℃反应1h,采用化学发光法进行显色,计算机灰度扫描处理。β-actin作为内参校正上样量。

1.5 RTJCR用T1izol试剂提取各组不同时间点海马总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度。在反应体系为犭uL的反转录管中,1uL Oligo(dT),2ug总RNA,20℃反应5min,冰上冷却5min,加人10mmol/LDm,5mm。l/L dNTP,2×10:U/L MMLⅤ反转录酶,再用无RNA酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)水补足至z-s uL,混匀后温育60min,95℃5min灭活反转录酶,终止反应。qMall探针RT-PCR反应体系为:2mm。l/LM四12,10×PCR缓冲液5uL,R0X 1uL,7·5um。l/L每个上下游引物混合物2uL,5umol/L TaqMan拐羽廾2uL,2.5mmol/L dNTP混合物4uL,cDNA模彻更4uL,Taq DNA彦聚合酶2.5U,用无RNA酶水补足体系至50uLo反应条件:%℃10m血然后9s℃15s,∞℃1mh共们个循环。反应在ABI730O型实时检测扩增仪上进行,根据标准品建立的标准曲线,计算待测样本中各目的基因和内参基因β-actin mRNA的准确含量。每个目的基因均重复检测3次。反应中所用引物序列见表1。

1.6统计学处理应用SPs16.0软件,数据以l±s表示,多组间比较采用单因素方差分析(F检验),P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠海马内神经细胞的凋亡TUNEL染色结果显示SE大鼠海马神经细胞的凋亡在12、48h 3个时间点明显高于对照组,以zh最为显著,sE十DG组大鼠海马凋亡细胞数目较SE组明显减少,见图1。

2.2各组大鼠海马ERS发生情况GR刀8是ERS的标志物,其表达的上调提示细胞内发生ERS。Wes-坨m bolt结果显示SE组大鼠GRPT8蛋白的表达于3h开始增加,6h达高峰,12h下降,与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01),以h和48h回落至正常对照组水平;正常对照组GRP98蛋白在各个时间点的表达差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。结果显示阢组大鼠GRPT8mRNA表达的时相改变与蛋白相似,于3h开始增加,6h达峰值,12h与正常对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.01),降至正常水平,见表3。sE+DG组GRP,8蛋白和基因水平的表达在SE发作后3h明显上调,6、12h明显下降(P均(0.01),见表2、3。

2.3各组大鼠海马ERs相关凋亡分子CHOP的激活正常对照组大鼠海马内CHOP蛋白表达非常低下;而在阢6h后开始有少量表达,12h明显增加:zh达高峰,与细胞凋亡的高峰时间点一致,48h的表达有所下降,但与正常对照组比较差异仍有统计学意义,见表4结果显示阢组大鼠CH0P mRNA的表达于6、12h开始增加,zh达高峰,48h仍高于对照组,见表5。CHOP mRNA和蛋白表达的时相变化相同,说明SE后,机体是在mRNA和蛋白2个水平上同时促进了CHOP的激活。SE+DG组各个时间点与sE组同一时间点(6、12、20h)比较CHOP蛋白和mRNA的表达均明显下降(P均<0.01),48h较阢组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表4、5。

3讨论

细胞凋亡,又称为程序性细胞死亡(PCD),是机体细胞在正常生理或病理状态下由相关基因调控发生的一种细胞主动性死亡方式。PCD是机体用来去除老化细胞及具有潜在性异常生长细胞的一种重要机制,是确保机体正常发育、维持机体正常生理过程所必需的。细胞增殖和凋亡的调控途径与许多疾病(如感染性疾病、艾滋病、自身免疫性疾病、神经性/神经发育性疾病等)的病因和发病机制有关。死亡受体活化(外源性途径)和线粒体损伤途径(内源性途径)是细胞内2条经典的凋亡途径。随着对细胞凋亡研究的深人,越来越多的证据表明,内质网也是调控细胞凋亡的重要细胞器[6]。内质网是一个动态的膜性细胞器,具有多种功能,包括蛋白质的合成、修饰、折叠和亚基的组合,类固醇合成和脂质合成等.

内质网的正常功能是细胞存活的必要条件,当其稳态被打乱和未折叠蛋白或错误蛋白聚集在内质网内,即可引发ERS。而此时细胞为了生存产生针对ERS的反应,以恢复或维持内质网的功能,称为ERS反应。迄今为止,已证实有4个不同的ERS反应阶段[7]:(1)抑制蛋白质的翻译,减轻内质网的负荷。(2)诱导内质网应激蛋白表达,如分子伴侣GR刀8和GRP94增强内质网的蛋白折叠能力。(3)内质网内错误折叠蛋白的降解,即内质网相关降解。(4)ERS诱导的细胞凋亡。当严重的或长时间的ERS损伤了内质网的功能时,细胞发生凋亡,以去除损伤的细胞。在ERS时,这4个阶段表现了时间的依赖性。sE作为一种应激原可引发神经细胞发生ERS。GRPT8位于内质网上,作为ERS反应标志性蛋白参与ERS,其表达的增加可促进错误折叠和未折叠蛋白恢复正常构象、维持内质网和胞质C+平衡并维持内质网内Ca2+依赖性蛋白修饰反应等效应,有助于减轻ERs以保护细胞。而当严重或长时间的ERS损伤了内质网功能时,可启动ERS特异性的凋亡途径——CH0P相关的凋亡途径,导致细胞死亡,以清除损伤的细胞。本研究的免疫组织化学、Western blot和RT-PCR结果证实,在SE发作后早期(3-12h),GRPT8mRNA和蛋白的表达均明显增加,6h达峰值,之后随时间延长(24-48h),其表达呈下降趋势,与正常对照组比较无明显差异。这可能与内质网自稳系统的调节作用有关,在阢后6h内质网自身的保护作用达到最佳水平;但SE后z-48h GR刀8表达下降,说明惊厥后神经细胞内质网功能可能出现障碍,没有能力促进GRPT8等分子伴侣的表达以结束ERS状态,此时内质网自稳调节系统遭到破坏,使神经细胞启动一系列死亡通路,导致细胞死亡[9]。CH0P也称为GADD153(即生长停滞及DNA损伤诱导基因,属于ERS特异性的一个转录因子[10],属于C/EBP转录因子家族成员[11]。一般情况下,CH0P主要存在于细胞质中,表达量很少,在ERS下,CHOP的表达会大大增加,过度表达的CH0P可进一步诱导细胞凋亡,CH0P介导的细胞凋亡主要是通过与cAMP反应元件结合蛋白形成二聚体,形成的二聚体再进一步抑制抗凋亡Bc”的表达,从而耗竭谷胱甘肽,增强线粒体对有关凋亡因子的敏感性,最终激活C灬pases,导致细胞凋亡[12]。本研究显示CH0P在癫痼发作6h后开始有少量表达,以h达到高峰,鲳h有所下降,仍高于正常对照组,与正常对照组同一时间点比较差异有统计学意义。

CHOP的动态变化说明了CH0P是在EBD早期发挥作用,可诱导EBD早期神经元的凋亡;CHOP在γh明显表达,提示SE对脑组织产生了损伤,EBD发生后启动了ERS凋亡机制中的CH0P途径,CH0P再通过上述的凋亡机制,抑制抗凋亡基因表达,最终导致细胞凋亡。另外,本研究显示CH0P在EBD后48h明显卞降,表明CHOP的表达持续时间短暂,在EBD后期作用不明显,从而可能为EBD的早期发病机制与防治研究提供新的思路。本结果还发现,SE发作后以-48h CH0P表达升高的同时,GR刀8表达下降,这说明CHOP的激活可抑制GR田8表达。综上,癫痼发作作为应激原引发了ERS反应,诱导GRPT8的大量表达来保护细胞,抵抗EBD。但长时间的损害,ERs过强,使内质网自稳调节发生障碍,保护机制不能与损失抗衡,启动内质网相关的CHOP凋亡通路,导致细胞凋亡。

因此,ERS相关的凋亡通路可能参与了EBD过程。EBD既是SE发作后的结果,又是癫痼反复发作得不到有效控制的一个根源。因此为了阻断这种因果关系,国内外研究者都在积极寻求合适的脑保护药物,以减轻EBD。本实验应用ERs的诱导剂2-DG后,GR刀8蛋白和基因的表达在早期(发作后3h)明显增高,后期表达逐渐减少;而凋亡分子CH0P蛋白和基因的表达在凋亡的高峰时间点较SE组明显减少,说明2-DG作为化学诱导剂诱发一定程度的ERS,从而激活细胞保护机制,增强细胞对更强刺激的抵抗力,即产生预适应保护,减轻EBD。也有研究认为依达拉奉、促红细胞生成素[14]可影响ERS,产生脑保护作用.总之,本实验结果很好地诠释了ERS既是细胞抵抗应激的重要机制,又是应激损伤细胞的重要机制。提示可以通过药物等方法提前干预,激活一定程度的ERS,使内质网分子伴侣等高表达,并产生强大的细胞保护效应,这可能成为细胞保护的重要策略之一。

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