长春地区儿童急性呼吸道感染人博卡病毒的研究
发表时间：2011-11-22 浏览次数：433次
作者：马均 作者单位：吉林省长春市儿童医院
【关键词】 儿童;急性呼吸道感染;病毒
2005年8月瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院的Allander等对急性呼吸道感染患儿样本进行大规模筛查时发现了2种新的病毒，其中一种随后鉴定为细小病毒科(Parvoviridae family)细小病毒亚科(subfamily parvovirinae)博卡病毒属(genus bocavirus)，被命名为人博卡病毒human bocavirus(HboV)。随后的国外学者研究认为HBoV可以引起儿童急性呼吸道感染，而且受到各国研究人员的广泛关注。我们对我院2008年1月1日～3月30日住院的560例急性呼吸道感染患儿咽拭子标本进行PCR扩增,有21例患儿咽拭子标本中存在这种新病毒基因片段,经序列分析确定为HBoV基因。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象及样本：研究对象为长春市儿童医院2008年1月1日～3月30日住院的急性呼吸道感染患儿560例，其中男 386例，女174例，所有研究对象均于入院次日晨无菌取咽拭子于1.0 ml DNA提取液中-20℃保存备用。
1.1.2 主要试剂及仪器：Taq DNA聚合酶、dNTP位TaKaRa产品，琼脂糖、分子量标准为北京鼎国生物公司产品。DNA扩增仪为美国产PTC-100。
1.1.3 引物选取及合成：HBoV基因核酸扩增引物参考澳大利亚Theo P Sloots的报道。上游引物为HboV1:5′-TAT GGC CAA GGC AAT CGT CCA AG-3′(1545-1567)，下游引物为HboV2:5′-GCC GCG TGA ACA TGA GAA ACA GA-3′(1835-1813) 。其在Genebank注册号为NC_007455。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 博卡病毒DNA提取：将含有咽拭子的DNA液10000转离心20秒，56℃30分钟，100℃10分钟，10 000转离心5分钟，留取上清液待进行PCR扩增。
1.2.2 PCR扩增：50 μl反应体系包括上述方法提取的DNA模板 5μl，50 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100，10 mmol/L(pH9.0)Tris-HCl,1.5 mmol/LMgCl2，200μmol/L dNTP，3 U TaqDNA聚合酶,上下游引物各1.0 μmol/L。反应条件为①94℃ 5 min;②94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,扩增35个循环;③72℃延伸7 min。预期扩增片段为291 bp。
1.3 结果判定：以100 bp ladber maker为分子量标准。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，电压50 v，电流80 A。在紫外可见光成像系统观察结果并拍照，扩增产物为291 bp片断。
1.4 序列测定:随机选取HBoV基因检测阳性标本中的8例,进行核苷酸序列测定。PCR产物纯化、克隆、质粒筛选、测序由上海英俊生物有限公司完成。
1.5 序列分析：利用NCBI中的BLAST网络工具提供的在线服务将所测序列与GenBank中的基因序列进行同源性分析。
2 结果
2.1 急性呼吸道感染患儿咽拭子中HboV检出率：560例急性上呼吸道感染患儿咽拭子标本，经PCR扩增，有21例患儿标本扩增出291 bp的单一扩增产物。本研究人博卡病毒阳性检出率为3.75%(21/560)。
2.2 HboV感染性别比：在21例HboV感染患儿中男性13例，女8例，男女比值是1.625。
2.3 HboV感染的临床表现：21例HboVDNA检测阳性患儿中20例临床资料齐全。咳嗽伴喘憋20例，(100%，20/20);37.0～38.5℃8例，(40%，8/20)，38.5～39℃2例，(10%，2/20);17例肺部听诊闻及中小水泡音伴喘鸣音，(85%，17/20)单纯中水泡音1例，(5%，1/20)，干性啰音8例，(40%，8/20);5例WBC在(10～13.7)×109，(25%，5/20);细胞分类淋巴细胞百分数均高于同年龄组正常数。X线胸片片状影12例(60%，12/20)。
2.4 HboV长春市儿童医院临床株核苷酸序列：在20例HboV阳性标本中随机选取8份PCR产物进行核苷酸序列测定。测序结果在GenBank中进行比较。8份测序结果均为人类博卡病毒，与GenBank中HboV标准株 st1(No.DQOO495)、HboV st2(No.DQ00496)、HboV BJ3722(No.DQ988934)、HboV Wll-1(No.DQ778300)比较显示该扩增片段的核苷酸同源性为99%～100%。
3 讨论
我们用针对HBoV NS1基因的特异引物对临床怀疑病毒感染的560例患儿咽拭子标本进行PCR扩增，结果有21例标本HBoV DNA片段检测阳性,阳性检出率为3.75%(21/560);国内外报道下呼吸道感染患儿HBoV检出率，瑞典[1]为3.1%，澳大利亚[2]为5.6%,日本[3]为 5.7%，国内湖南为8.3%，浙江为2.92%，北京为4.1%;我们的结果与北京接近。HBoV是引起小儿急性呼吸道感染的病源之一;对于病原不明确的病毒性呼吸道感染有必要进一步探索其感染源。
【参考文献】
[1] Allander T，Tammi MT，Eriksson M，et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J].PNAS，2005，102(36)：12891.
[2] Sloots TP，McErlean P，Speicher DJ，et al.Evidence of human coronavirus HKU1 and human bocavirus in Australian children[J].J Clin Virol，2006，35(1)：99.
[3] Ma X，Endo R，Ishiguro N，et al.Detection
