胆固醇7α羟化酶基因多态性与小儿血脂的关系
发表时间：2011-10-25 浏览次数：434次
作者：王程强,汪春红,张妍 作者单位：桂林医学院预防医学教研室,广西 桂林 541001
【摘要】目的：探讨胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7αhydroxylase， CYP7A1)基因多态性与湖北儿童血脂水平的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCRRFLP)对216例健康儿童CYP7A1基因的A204C基因座进行Eco31I酶切多态性分析，血脂测定在全自动化分析仪上进行。结果:研究人群中CYP7A1基因的3型频率分别为：AA型6.0%，AC型26.4%、CC型67.6%。AA基因型在LDLC, TC, Lp(a)水平上均低于其他基因型，并且其差异具有显著性。CC基因型在HDLC水平上均高于其他基因型，并且其差异具有显著性。3型在ApoA上两两之间均存在显著性差异，而在TG中无显著性差异。结论：CC基因型在研究人群中所占的比例最高，AA基因型所占的比例最小。CYP7A1的基因多态性与儿童的血脂水平存在密切的关系。
【关键词】 胆固醇7α羟化酶基因;单核苷酸多态性;血脂;儿童
Relationships between polymorphism of CYP7A1 gene and serum lipid levels in children
WANG Chengqiang1， WANG Chunhong2， ZHANG Yan2
(1.Department of Preventive Medicine, Guilin Medical College Guilin 541001,China;2. School of Public Health, Wuhan University Wuhan 430000,China)
[ABSTRACT] Objective: To study the relationships between the polymorphism of CYP7A1 gene and the serum lipid levels in children in Hubei province. Methods: The study subjects consisted of 216 healthy children who were randomly selected from the school. The frequency distribution of the polymorphism in nucleotide A204C of 7αhydroxylase gene was detected using PCRRELP. The serum lipid levels were determined using automatic biochemical analyzer. Results: The frequencies of AA, AC and CC genotypes were 6.0%, 26.4% and 67.6% respectively. There were significant differences in low density lipoprotein cholesterol (LDLC), total cholesterol (TC), lipoprotein (a) levels among CC, CA and AA genotypes; in children with AA genotype, which were all lower than those in other genotypes (P<0.05); the levels of high density lipoprotein cholesterol (HDLC) in children with CC genotype were higher than those in other genotypes (P<0.05).There were no significant differences of the genotypes in triglycerides (TG) while significant differences among the three genotypes in ApoA. Conclusion: CC genotype is most common in children, AA genotype is least.There are close relationships between the polymorphism of the CYP7A1 gene and lipid levels in children.
[KEY WORDS] Cholesterol 7αhydroxylase (CYP7A1) gene; Singlestranded conformation polymorphism (SSCP); Serum lipid; Children
胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7αhydroxylase， CYP7A1)作为由胆固醇转变为胆汁酸的限速酶，是决定血浆胆固醇水平的一个重要因子。胆固醇在肝中转化为胆汁酸是胆固醇在体内代谢的主要途径。机体有2条胆汁酸生成途径，即经典途径和替代途径，胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)和胆固醇27α羟化酶(cholesterol 27αhydroxylase, CYP27)分别是这2条途径的限速酶，通常情况下由CYP7A1起始的经典途径在胆汁酸的合成中占主导地位[1]。临床研究表明,CYP7A1基因多态性与胆固醇的代谢有密切的关系[2]。
王程强等.胆固醇7α羟化酶基因多态性与小儿血脂的关系 海南医学院学报 Vol.14 No.1 Feb.2008人CYP7A1基因位于8号染色体长臂(8q1112),长约11 kb,由6个外显子和5个内含子组成，编码含有492个氨基酸的多肽[3,4]。目前该基因存在28个单核苷酸多态位点，但对它们的研究都比较有限。本课题试图通过调查湖北地区儿童CYP7A1基因A204C多态性,了解CYP7A1各种基因型在调查地区儿童中的分布频率，并初步探讨它们与脂代谢的关系。
1 材料和方法
1.1 对象
整群分层随机抽样方法，在湖北省浠水县抽取6～9岁学龄儿童216名。
1.2 指标测定
1.2.1 生化指标 空腹12 h采静脉血3 mL，分离血清用于检测血脂含量。采用酶法测定血浆甘油三脂(TG)和总胆固醇(TC);选择遮蔽法测定低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDLC);免疫透射比浊法测定脂蛋白(a)[LP(a)],载脂蛋白A1(apoA1)和载脂蛋白B(apoB)。测定试剂均由日本第一化学药品株式会社提供。以上测定均在武汉大学中南医院检验中心全自动化生化分析仪(美国雅培Aeroset)上进行，严格按照仪器、试剂和方法学的操作规程进行测定，血脂测定多项质控物由日本第一化学药品株式会社提供。
1.2.2 基因分型 碘化钠法提取外周血白细胞基因组DNA。PCR引物参照文献[5]及引物设计软件Primer 5.00设计而成。
上游引物为5-GAAAGGGAAGGATGCCACT-3
下游引物为5-ATGCCCATCTTAAACAG-3
PCR反应体系(25 μL)包含0.2 μg基因组DNA,1.5 μmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP,1.5 mmol/L MgCl2,1 U Tag DNA聚合酶及10×PCR缓冲液。反应在热循环仪Hema上进行,反应条件为:94 ℃ 预变性5 min,然后94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,35次循环后72 ℃延伸10 min。
取10 μL PCR产物(325 bp)加入限制性内切酶Eco31I 5 U 37 ℃温浴过夜，酶切产物用经过3%琼脂糖电泳，用凝胶成像系统(Hema)观察并记录电泳结果。
上述引物由上海生工生物工程公司合成，TaqDNA聚合酶、限制性内切核酸酶Eco31I均购于晶美生物工程公司。
1.3 统计学分析
基因频率采用基因计数法计算, 按HardyWeinberg平衡原理确认样本的群体代表性。各种基因型之间的血脂水平差异的显著性检验用单因素方差分析。所用的统计软件为SPSS11.0软件包。
2 结果
2.1 CYP7A1基因型分布
研究人群中CYP7A1基因A204C多态性出现了3种基因型：1条190 bp和1条135 bp的纯合子(CC); 190，135，100 bp和35 bp共4条带的杂合子(AC);以及190，100 bp和35 bp共3条带的纯合子(AA)。因为35 bp条带的分子量比较小，与引物二聚体位置接近而较难观测到。3种基因型频率分别为：AA型6.0%、AC型26.4%、CC型67.6%;基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡原理(χ2=4.953，P>0.05), 即研究儿童有较好的群体代表性。等位基因C、A的频率分别为计算得到0.81,0.19。注：M: DNA Marker(MSM26/Sangon);Lane1、4: AA基因型;Lane2、3: AC基因型;Lane5: CC基因型;Lane7: PCR产物。
2.2 基因型与血脂水平的关系
AA基因型在LDLC,TC,Lp(a)水平上均低于其他基因型，并且其差异具有显著性。CC基因型在HDLC水平上均高于其他基因型，并且其差异具有显著性。3型在ApoA上两两之间均存在显著性差异，而在TG中无显著性差异。见表1。表1 儿童CYP7A1基因多态性与血脂水平的关系 注：*P<0.05, Lpa数据是偏态分布，用中位数及四分位间距表示。HDLC，LDLC，TC，TG，ApoA,ApoB数据均成正态分布，以均数加减标准差表示。
3 讨论
本研究儿童中等位基因C,A的频率分别为0.81，0.19，与上海及四川学者报道[6，7]的成年健康汉族人群中该两等位基因的分布频率一致，上海地区等位基因的频率A为0.20、C为0.80，四川地区分别是A为0.16、C为0.84，可认为年龄对汉族人群中CYP7A1基因A-204C多态性分布影响不大。但与文献报道的白种人群C、A等位基因频率分布(0.40，0.60)相比较,差异有显著性意义(P<0.05)。是否为人种上的差异,有待进一步研究。
CYP7A1作为胆汁酸合成的限速酶参与胆固醇代谢，对于维持胆固醇的动态平衡有着重要作用。临床研究已明确显示，胆汁酸合成与低密度脂蛋白胆固醇水平存在相关性[6]。对湖北浠水地区216名儿童进行的CYP7A1基因A-204C多态性分析，发现AA、AC、CC 3种基因型之间总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇的差异均具有显著性。根据文献报道，造成血浆低密度脂蛋白胆固醇水平个体差异的因素中遗传占到50%，而在大多数家庭中，高低密度脂蛋白胆固醇血症，不遵循孟德尔法则，故推测造成低密度脂蛋白胆固醇不同浓度的遗传差异与调节低密度脂蛋白胆固醇代谢的基因有关。本研究中血低密度脂蛋白胆固醇水平在CC纯合子型中显著高于AA纯合子携带者(P<0.05)，尽管CC与AC型之间差异没有显著性，但CC、AC、AA型之间的低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇出现梯度下降。由于低密度脂蛋白胆固醇主要是由肝脏合成运送到外周的胆固醇，高密度脂蛋白胆固醇是逆向转运胆固醇的主要形式，而CYP7A1是胆汁酸代谢中由胆固醇生成胆汁酸的主要限速酶。因此，CYP7A1对低密度脂蛋白胆固醇具有更显著的作用。
ApoA是HDL的主要载脂蛋白，ApoB几乎是LDL中唯一的载脂蛋白，主要参与胆汁转运及被细胞膜上的LDL受体识别[7]，且研究发现AA型和CC型比较ApoA、B水平时差异均有显著性意义，在AA、AC、CC 3种基因型之间，浓度呈现梯度性上升。可以说ApoA、B与CYP7A1的基因多态性也有密切的关系。
Lp(a)水平同年龄、性别及其他血脂浓度无关。血清Lp(a)浓度主要由遗传决定，具有独立的代谢途径[8]。Lp(a)由ApoA和ApoB通过二硫键连接而成，其结构由脂肪酸组成，抗氧化剂含量及体外氧化行为与低密度脂蛋白相似。Lp(a)水平由基因控制，与ApoA的多态性相关[9]。本研究中与CYP7A1的基因的多态性也存在密切关系，CC型人群其Lp(a)及LDLC的水平均是最高的，似乎更容易发生高脂血症，但由于样本的含量较小，要得出明确的相关结论需要下一步扩大样本量研究。
至于甘油三酯，统计学分析显示,不同的基因型对其并没有显著性差异，这与文献报道的一致[10]。
综上所述,CYP7A1基因以CC基因型常见，约占67.6%。除TG外，CC基因型携带者的另6项血脂指标与AA基因型者比较均出现显著性差异(P<0.05)。所以说，CYP7A1的基因多态性与血脂存在着密切的关系。
【参考文献】
1 李燕.胆固醇和脂肪酸对CYP7A1的调节[J]. 国外医学(内科学分册),2004,31:14.
2 Wang J, Freeman DJ, Grundy SM, et al. Linkage between cholesterol 7-hydroxylase and high plasma low-density lipoprotein cholesterol concentrations[J]. J Clin Invest, 1998,101: 12831291.
3 裴学文，吴庆刚，徐威，等.微量元素与冠心病关系初探[J].中国公共卫生,2001,17:302304.
4 陆志强,高鑫,胡予,等.中国上海人群胆固醇7α-羟化酶基因多态性与高低密度脂肪蛋白胆固醇血症的关系研究[J].中国临床医学,2001，8:378379.
5 Reihner E,Angelin B,Rudling M, et al. Regulation of hepatic cholesterol metabolism in humans: stimulatory effects of cholestyramine on HMG-CoA reductase activity and low density lipoprotein receptor expression in gallstone patients[J]. J Lipid Res,1990,31:22192226.
6 周斌,张思仲,肖翠英,等.胆固醇7α羟化酶基因A204C单核苷酸多态性及其与血浆血脂的关系[J].遗传,2004,26:283286.
7 李清芳，安翠平 .Apo-1与ApoB与其相应血脂成份关系探讨[J].河北医药,2005，27:217218.
8 Kronenberg, Koning P, Neyerll, et al. Multicenter study of lipoprotein(a) and Apo ( a ) phentypes in patients with end - stage renal disease treated by hemodialysis or continuous ambulatory peritoneal dialysis [J].JAM Soc2 Nephrol,2001,6:110114.
9 陈大宁，汪俊军，张春妮.高脂血症患者血清脂蛋白(a)及其特异性循环免疫复合物水平[J].医学研究生学报,2004,17:100102.
10 Maaike K, Hofman, Rianne M. CYP7A1 A278-C polymorphism affects the response of plasma lipids afer dietary cholesterol or cafestol interventions in Humans[J].Journal of Nutrition Sep,2004,134:910.
