喘息性肺炎患儿外周血CD137和CD28及T细胞亚群的表达研究

　　作者：王素梅 潘同国 杨玉梅 作者单位：442000 湖北省十堰市，郧阳医学院附属太和医院儿科

　　【摘要】 目的 探讨喘息性肺炎患儿外周血CD137、CD28共刺激分子和T细胞亚群的表达改变及意义。方法 根据患儿肺部体征将支气管肺炎分为喘息性肺炎组和非喘息性肺炎组，用流式细胞仪(FCM) 检测喘息性肺炎患儿及正常儿童外周血中共刺激分子CD137、CD28和T细胞亚群的表达，并通过数据对比寻求其规律。结果 共刺激分子CD137的表达：正常人组，未经PHA活化的T细胞表面几乎无CD137表达，经PHA活化24 h后，表达率为(19.92±1.98)%，喘息性肺炎组未经PHA活化的T细胞表面已有CD137表达，经PHA刺激24 h后，CD137在T细胞上的表达率为明显高于正常人(P<0.01)。T细胞亚群分析显示，CD137在CD+4T细胞、CD+8T细胞上均有表达，并发现在CD+4T细胞上表达多于CD+8T细胞。且与正常人和非喘息组比较CD137表达的T细胞亚群差异有统计学意义(P<0.01)。共刺激分子CD28的表达：喘息性肺炎组共刺激分子CD28表达水平与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。T细胞亚群分析显示喘息性肺炎患儿CD+8、CD+28较对照组升高(P<0.05)，CD+8CD28、CD+4CD+28较对照组降低(P<0.05)，CD+4、CD28与对照组相比差异无统计学意义。喘息性肺炎中过敏原阳性组CD137水平较过敏原阴性组升高(P<0.05)，CD137的T细胞亚群表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 共刺激分子CD137参与了喘息性肺炎的发病机制，阻断第二信号有望成为治疗喘息性肺炎的一条新途径。

　　【关键词】 喘息性肺炎;CD137; CD28;T细胞亚群;表达

　　喘息性肺炎是儿内科常见病。因此，目前认为喘息性肺炎和哮喘之间在发病机制间存在某种联系。支气管哮喘是由多种炎性细胞及活性因子的级联反应引起的慢性气道炎症，在这些炎性细胞中，T淋巴细胞起着核心作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 支气管肺炎患儿：选取2007年1月至2009年6月因支气管肺炎住我科治疗的婴幼儿78例，其中男37例，女41例;平均年龄(1.8±0.7)岁，支气管肺炎诊断符合《实用儿科学》(第七版)[2]：根据发热、咳嗽、气促或呼吸困难，肺部有固定的中细湿啰音可进行临床诊断，少部分患儿可有融合病灶，出现叩诊浊音，听诊闻及管状呼吸音;X线胸片：最常见征象为肺野中内带小片影或小斑片影，有融合病灶时可出现较大片状影，有些病毒引起的间质性肺炎可见到细点网状影，确诊须做胸片及病原学检查。其中伴喘鸣的支气管肺炎40例(喘息性肝炎组)，平均年龄(1.7±0.5)岁;无喘鸣38例(非喘息性肺炎组)，平均年龄(1.6±0.6)岁。正常对照组为同期在本院体检的某幼儿园健康儿童30名，其中男17例，女13例，平均年龄(1.6±0.6)岁，近1月来无呼吸道感染史，无先天性心脏病史，家族中也无哮喘史，无其他疾病导致呼吸中枢神经失调症状，无肺部畸形，无先天性喉软骨发育不全。

　　1.2 T淋巴细胞表型检测 FITC/PE双标记单克隆抗体购于荷兰Sanquin公司，原装进口美国BD FACS Calibur流式细胞仪。严格无菌操作，采取2组入院次日晨空腹外周静脉血2 ml，于各测试管中加入100 μl肝素抗凝，再分别加入FITC/PE双标记单克隆抗体2 μl，室温孵育20 min后QPrep系统溶解红细胞，2 000 r/min离心5 min，除去上清液后以磷酸盐缓冲液PBS漂洗2次，以标准微球调整流式细胞仪，使变异系数在2%以内，上机检测5 000个细胞，荧光强度以对数放大,检验2组外周血单个核细胞中T细胞亚群表面标志及活化后T淋巴细胞表面分子的表达：淋巴细胞亚群(CD+3、CD+3CD+4、CD+3CD+8、CD+4/CD+8、CD-3CD+19)，共刺激分子CD28、 CD137及CD+4CD+28、CD+8CD+28、CD+4CD-28、CD+8CD-28、CD+4 CD+137、CD+8CD+137细胞亚群。

　　1.3 统计学分析 应用SAS 6.12统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 共刺激分子CD137的表达 正常对照组，未经PHA活化的T细胞表面几乎无CD137表达，经PHA活化24 h后，表达率为(19.67±2.00 )%，喘息性肺炎组未经PHA活化的T细胞表面已有CD137表达，经PHA刺激24 h后，CD137在T细胞上的表达率明显高于正常人(P<0.01)。 T细胞亚群分析显示，CD137在CD+4 T细胞、CD+8 T细胞上均有表达，并发现在CD+4 T细胞上表达多于CD+8 T细胞。且与正常人和非喘息组比较CD137表达的T细胞业群差异有显著性(P<0.01)。见表1、2。

　　表1 3组未刺激前共刺激分子CD137表达水平比较%，±s

　　组别CD+137CD+4CD+137CD+8CD+137CD+137CD+4CD+137CD+8CD+137

　　喘息性肺炎组(n=40)4.21±0.362.01±0.440.96±0.2535.2±4.01ba20.10±3.18ba12.2±2.93b

　　非喘息性肺炎组(n=38)0.89±0.220.66±0.120.18±0.07ba22.4±3.612.01±3.447.53±1.72

　　正常对照组(n=30)0.82±0.190.61±0.140.17±0.0719.9±2.011.88±1.527.36±0.70

　　F值8.338.018.008.347.579.25

　　P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

　　b与正常组相比，P<0.01a与非喘息性肺炎组相比，P<0.01

　　2.2 共刺激分子CD28的表达 喘息性肺炎组共刺激分子CD28表达水平与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。T细胞亚群分析显示，喘息性肺炎患儿CD+8CD+28较正常对照组升高(P<0.05)， CD+8CD-28， CD+4CD+28较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，CD4+CD28与对照组相比无显著性差异。见表2。

　　表3 喘息性肺炎患儿共刺激分子CD28的表达水平%,±s

　　分类喘息性肺炎组非喘息型肺炎组正常对照组F值P值

　　CD28 50.2±3.0 53.2±3.755.1±4.02.41>0.05

　　CD4+CD28+ 25±4*△36±437±454<0.01

　　CD8+CD28+ 16.2±2.6*△13.6±2.513.2±1.053<0.05

　　CD4+CD28-0.7±0.30.7±0.40.7±0.30.24>0.05

　　CD8+CD28- 6.8±2.1#△8.9±2.08.4±1.67.88<0.01

　　注：与正常对照组比较，*P<0.05，#P<0.01;与非喘息性肺炎组相比，△P<0.05，☆P<0.01

　　2.3 治疗后喘息性肺炎患儿的CD137表达 喘息性肺炎患儿治疗后CD137表达明显下降。见表3。

　　表3 喘息性肺炎患儿治疗前后共刺激分子CD137表达%,±s

　　CD137CD+4 CD+137CD+8CD+137

　　治疗前 31±6*18.3±5*11.2±3.2*

　　治疗后19±611.2±1.76.9±2.1

　　t值7.827.325.02

　　P值P<0.01P<0.01P<0.01

　　注：与治疗后比较，*P<0.01

　　2.4 喘息性肺炎患儿淋巴细胞亚群变化 喘息性肺炎组CD+3、CD+3CD+4、CD+4/CD+8较正常组降低，差异有统计学意义，CD3-CD+19表达明显升高，亦有统计学意义，CD+3CD+8无显著性差异。见表4。

　　表4 喘息性肺炎患儿淋巴细胞亚群变化%,±s

　　分类喘息性肺炎组非喘息型肺炎组正常对照组F值P值

　　CD3+ 54±7*#61±762±748.65<0.01

　　CD3+CD4+29±7*#38±738±655.33<0.01

　　CD3+CD8+21±621±621±60.26>0.05

　　CD4+ CD8+1.3±0.9*#1.8±0.71.7±0.39.65<0.01

　　CD3-CD9+30±9*#21±516±97.25<0.01

　　注：与正常组相比，*P<0.01; 与非喘息性肺炎组相比，#P<0.01

　　3 讨论

　　目前，国内、外有关喘息性肺炎外周血T细胞及其亚群报道不一，为此，我们运用免疫荧光标记技术和流式细胞仪分析，对喘息性肺炎患儿外周血T细胞亚群及共刺激分子CD28、CD137等水平表达进行了检测，目前认为喘息性肺炎和哮喘之间在发病机制上存在某种联系[3]。本实验结果显示：共刺激分子CD28、CD137在喘息性肺炎致病中起了重要作用，喘息性肺炎患儿存在T细胞及其亚群的失衡，本研究表明，随着共刺激分子研究的不断深入，阻断第二信号有望成为治疗喘息性肺炎的一条新途径。

　　支气管哮喘是由多种炎性细胞及活性因子的级联反应引起的慢性气道炎症，在这些炎性细胞中，T淋巴细胞起着核心作用[4]。T淋巴细胞的活化是哮喘炎症级联反应的触发点，活化过程不仅需要抗原特异的识别信号，而且需要T淋巴细胞表面共刺激分子与抗原提呈细胞(APC)表面相应配体结合产生的共刺激信号[5]。若缺少第二信号即共刺激信号，T细胞则无应答或进入无反应状态，甚至凋亡;若第二信号过度表达，则导致T细胞功能紊乱。近年来，大量体内、外实验证明[6]，多对共刺激分子在T细胞活化、分化、增殖的不同阶段介导不同的生物学效应，主要有B7/CD28、CD40/CD40L、CD137/CD137L、Ob40/Ob40L等。由于T细胞的异常激活，导致了多种相关细胞因子、炎性介质释放及炎性细胞浸润，推进了疾病的发生、发展。虽然现在通过吸入糖皮质激素进行干预，但激素的反复使用会产生一定的不良反应，导致机体正常免疫功能的下降。鉴于对哮喘发病机制的认识，引入免疫耐受治疗(通过阻断共刺激通路)不仅有了理论依据，还有现实需要。

　　【参考文献】

　　1 诸福棠.主编.实用儿科学.第7版.北京:人民卫生出版社，1996.11711172.

　　2 Watts TH.TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses.Annual Review of immunology，2005，23:2368.

　　3 齐建光，张韶杰，陈永红，等.儿童重症支原体肺炎的临床特征和治疗探讨.中国当代儿科杂志，2008，12：719721.

　　4 陈捷，王兰兰.共刺激分子4-1BB在T细胞活化效应中的作用.四川医学，2006，8：793795.

　　5 杨勇，王瑜，陈宗波，等.难治性肺炎支原体肺炎患儿T细胞活化功能状态的变化.实用儿科临床杂志，2006，10：14001411.