酶联免疫斑点技术辅助诊断小儿结核性脑膜炎的临床意义

　　作者：韩文，张卫平，何萍，多力坤·木扎帕尔 作者单位：新疆医科大学第一附属医院儿科, 新疆 乌鲁木齐 830011

　　【摘要】 目的：探讨酶联免疫斑点技术(ELISPOT)在小儿结核性脑膜炎诊断中的应用价值。方法：收集0～14岁疑似结核性脑膜炎患儿共17例进行ELISPOT检测，对最终确诊病例进行分析，并与头颅CT/MRI检查、结核菌纯蛋白衍生物试验(PPD)试验、脑脊液检查、结核抗体检查、胸片结果相对比。结果：在最终确诊的13例结核性脑膜炎中，头颅CT/MRI、PPD、脑脊液、结核抗体、胸片在入院5 d内的检查阳性率分别为30.8%、30.8%、23.1%、12.5%、30.8%,而ELISPOT阳性率为76.9%，显著高于其它辅助检查方法(P<0.05)。结论：ELISPOT检查灵敏、快速，对于小儿结核性脑膜炎有早期诊断价值。

　　【关键词】 酶联免疫斑点技术; 小儿; 结核性脑膜炎

　　Analysis of the utility of enzyme-linked immunospot assay in children with tuberculous meningitis

　　HAN Wen, ZHANG Wei-ping, HE Ping, et al

　　(Department of Pediatrics, First Afiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011，China)

　　Abstract: Objective: To analyze the diagnostic utility of enzyme-linked immunospot assay in children with tuberculous meningitis.Methods: Total of seventeen children aged from 0～14 years who were assessed for suspected tuberculous meningitis were enrolled in this study and were detected by enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT), the result was compared with the final clinical diagnosis as well as the results of CT/MRI，PPD test, cerebrospinal fluid test，tuberculosis antibody test，and chest X-ray test.Results: In 13 cases who were finally diagnosed of tuberculous meningitis, the positive rate of CT/MRI，PPD test, cerebrospinal fluid test，tuberculosis antibody test，and chest X-ray test in the early 5 days of hospitalization are 30.8%, 30.8%, 23.1%, 12.5% and 30.8% respectively, while the positive rate of ELISPOT was 76.9%, significantly higher than those in other diagnostic methods (P<0.05).Conclusion: Enzyme-linked immunospot assay has better early diagnostic value than other traditional diagnostic methods.It can be used in the early diagnosis of tuberculous meningitis in children.

　　Key words： enzyme-linked immunospot assay; children; tuberculous meningitis

　　酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)是一种从单细胞水平检测分泌抗体或细胞因子细胞的免疫学新技术[1,2]。近年来基于两种结核菌特异性抗原早期分泌抗原靶6(early secretory antigen target-6,ESAT-6)、培养滤液蛋白10(culture filtrate protein-10,CFP-10)的ELISPOT技术以其敏感、特异、简便的优点被用于结核病的诊断，取得了较好的成效[2～5]，在欧美已被批准用于临床，但在国内尚处于试用阶段。我科将该项技术试用于小儿结核性脑膜炎(结脑)的辅助诊断，与其它常规辅助检查做对比，探讨ELISPOT在小儿结脑中的诊断价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 收集我科2006年9月～2007年9月收治的0～14岁疑似结脑患儿共17例，诊断标准参照文献[6]，有其他明确中枢神经系统疾病者除外，并排除已经抗结核治疗超过1个月者。入选患儿男性8例，女性9例，年龄2个月～14岁，平均6岁9个月，其中0～5岁7例，5～14岁10例，汉族6例，维吾尔族10例，蒙古族1例。

　　1.2 方法 17例在入院5 d内进行胸片、结核菌纯蛋白衍生物试验(PPD)、脑脊液、头颅CT/MRI检查，采集卡介苗接种史、卡介苗接种后疤痕、既往结核病史及结核病接触史资料，部分患儿进行了结核抗体检测。同期采集静脉血2～8 ml,分离出外周血单个核细胞，利用ELISPOT试剂盒(Oxford Immunotec Ltd.)进行检测,每人份4孔，分别为测试孔A、测试孔B和阳性对照、阴性对照，所有试验操作步骤严格依据试剂盒内所附使用指导进行，最后用ChampSpotⅡTm型ELISPOT酶联斑点图像分析仪(北京赛智创业科技有限公司)进行计数分析。根据临床需要在15～40 d进行头颅CT/MRI复查。

　　1.3 判断标准 当阴性对照孔有0～5个斑点时，测试孔A或B斑点数-阴性对照孔斑点数≥6;或当阴性对照孔斑点数≥6时，测试孔A或B斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数时结果判定为阳性;若阳性对照孔反应良好，但测试孔斑点数未达上述标准，则为阴性。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,ELSPOT与其他诊断方法阳性率比较采用χ检验,检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 一般情况 17例中临床确诊结脑13例(76.5%)，其余4例(23.5%)分别为病毒性脑炎2例，中毒性脑病1例，化脓性脑膜炎1例。13例结脑病例中有卡介苗接种后疤痕者5例(38.5%)，有明确结核病接触史者4例(30.8%)，结脑临床分期早期2例(15.4%)，中期10例(76.9%)，晚期1例(7.69%，死亡)，合并粟粒性肺结核2例(15.4%)。

　　2.2 ELSPOT试验结果 在确诊结脑的13例中，经ELSPOT检测阳性10例(76.9%)，阴性3例(23.1%)。非结脑病例中ELSPOT检测无1例阳性。典型ELSPOT结果见图1。

　　注：每孔左上角数字为ELISPOT酶联斑点图像分析仪自动计数结果

　　图1 典型ELSPOT结果(略)

　　2.3 ELISPOT与其它各种方法检查阳性率的比较 确诊结脑13例中，入院5d内ELISPOT阳性率为76.9%，头颅CT/MRI、PPD、脑脊液、结核抗体、胸片检查的阳性率分别为30.8%、[JP2]30.8%、23.1%、12.5%、30.8%, ELISPOT阳性率显著高于其它辅助检查(P<0.05)。经过复查，入院40 d头颅CT/MRI阳性率达到61.5%,与ELISPOT早期阳性率对比差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

　　表1 ELSPOT与其它各种方法检查阳性率的比较(略)

　　注：(1)PPD试验结果以72 h硬结直径≥5 mm为阳性; (2)以同时进行了ELISPOT和结核抗体检测的人数进行配对χ检验

　　3 讨论

　　结脑是最严重的肺外结核病，约占儿童结核病死亡的75%，延误诊断是死亡的主要原因[7]，早期诊断、合理治疗可以明显改善其预后。目前对小儿结脑诊断主要依靠病史、结核病接触史、PPD、颅脑影像学检查、脑脊液检查等综合判断。由于疾病发展阶段及自身免疫力的不同,小儿结脑临床表现复杂多样,特异性差，早期诊断困难，容易延误诊断甚至误诊。

　　ELISPOT能高效地检测抗体/细胞因子分泌细胞，具有高度的敏感性 [8];而两种抗原ESAT-6、CFP-10只存在于结核分枝杆菌和少数非结核分枝杆菌,在卡介苗及大多数非结核分枝杆菌中不存在,故ELISPOT检测不会因既往卡介苗接种而出现假阳性反应[9]。Liebeschuetz等[5]在南非的一项前瞻、双盲队列研究结果表明ELISPOT诊断儿童结核病的敏感性为83%，显著高于结核菌素皮肤试验(63%)，并且受小于3岁、合并人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或营养不良等因素影响较小。Nicol等[10] 研究也表明，在确诊的儿童结核病例中，ELISPOT具有较高的敏感性(83%)。孟成艳等[11]报道了1例ELISPOT在成人不典型结核性脑膜炎诊断中的应用，取得了良好的指导效果。

　　本研究表明，ELISPOT早期诊断小儿结脑的阳性率达到76.9%，显著高于其它辅助检查。头颅CT/MRI初次检查阳性率为30.8%(4/13),明显低于ELISPOT(χ=4.5, P<0.05)，随着病情的进展和影像学复查，头颅CT/MRI检查的阳性率有所升高，入院40 d头颅影像学有典型改变(脑积水或基底池区脑膜异常强化)者达61.5%(8/13)，与ELISPOT早期阳性率相比差异无统计学意义(χ=1.0，P>0.05)，提示头颅CT/MRI检查早期表现缺乏特异性，对早期诊断不明确的病例需要进行CT/MRI动态追踪检查。PPD在严重结核病(结脑、粟粒性结核)时受机体免疫状态影响阳性率较低，本次研究中PPD阳性率明显低于ELISPOT，PPD阳性者ELISPOT均为阳性;PPD 72 h硬结直径均小于15 mm，其中3例硬结直径小于10 mm，在广泛接种卡介苗的新疆地区因无法排除卡介苗的影响，诊断价值有限，而ELISPOT由于不受既往卡介苗接种的影响，其阳性结果更支持结脑的诊断。脑脊液检查是结脑诊断的重要手段之一，然而结脑早期脑脊液变化特异性并不高，对于脑脊液变化不典型的病例早期很难与其他类型脑炎、脑膜炎相鉴别。方芳等[12]总结了103例小儿结脑后发现，初次脑脊液检查有典型改变者仅49.4%，本组病例中初次脑脊液检查有诊断意义者阳性率更低，仅占23.1%，均为结脑中、晚期患儿，因而单次脑脊液检查的诊断价值有限，不利于早期诊断的确立。动态追踪脑脊液变化有望提高诊断的阳性率。而ELISPOT早期阳性率显著高于脑脊液检查，提示ELISPOT对早期诊断更敏感。小儿结脑脑脊液的细菌学检查阳性率低[12]，本组所有病例脑脊液涂片无1例找到抗酸杆菌，提示目前小儿结脑的诊断仍应以临床诊断为主。本组在8例进行了结核抗体检测的结脑的患儿中，仅1例(12.5%)阳性，同期ELISPOT阳性率为87.5%(7/8)，明显高于前者(χ=6.0, P<0.05)，说明结核抗体在小儿结脑中诊断价值不高，这与方芳[12]、徐艳霞等[13]研究结果一致。胸片早期有异常改变4例(30.8%)，其中2例为粟粒性肺结核，1例肺门影增大，另有1例肺门淋巴结钙化。然而结核因其胸片表现多样、读片主观性强，常常被临床医师忽视而造成误诊，延误治疗时机。2例粟粒性肺结核早期均被误诊为支气管肺炎，肺门淋巴结钙化被认为是陈旧性结核病灶而不作为结脑的辅助诊断依据，相比之下ELISPOT检查结果更灵敏、更客观，不易受临床医师及检验师的主观影响。

　　临床上小儿结脑常没有明显的分期界限。部分病例起病急,前驱症状不明显[6，12],首发即表现为频繁抽搐、意识障碍，临床表现急、重，早期诊断困难，误诊率高，而ELISPOT可以灵敏地检测出结核感染[2,3,14]，能在发病早期为临床提供可靠的病因诊断依据，避免延误治疗时机。本组13例确诊病例中，有6例院外误诊，误诊率高达46.2%，而入院后其中4例(66.7%)ELISPOT阳性，为临床诊断的确立提供了有益的指导，提示ELISPOT检测在疾病早期有重要的鉴别诊断价值。

　　本研究中ELISPOT诊断小儿结脑的阳性率为76.9%，较文献报道的敏感性(83%)[5,10]稍低，但这些文献均以儿童活动性结核病为研究对象，而非单独的结脑病例，这种差异一方面可能由于同一方法对不同部位疾病的诊断敏感性有所不同，另一方面本组病例数较少也可能导致这种差异，有待于今后大规模、前瞻性的研究能够更有力的证明ELISPOT对小儿结脑的诊断价值。

　　ELISPOT诊断小儿结脑较其它传统辅助检查方法更灵敏，结果更客观，而且操作简便、快速(24 h可出结果)，可作为小儿结脑有价值的辅助诊断依据，适用于小儿结脑的早期、快速诊断，尤其对于那些临床表现不典型、常规辅助方法不能明确诊断的疑似结脑病例具有较高的诊断价值，与其它传统诊断方法相结合，可望提高早期诊断的准确性。

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