小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定

　　作者：肖莉　刘勇　高亚 作者单位：西安交通大学医学院：第二附属医院小儿外科，陕西西安 710004;环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells, GNCSCs)的方法，为临床应用奠定基础。方法 分离胚鼠肠管，消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基，贴壁培养;连续传代后用血清促进GNCSCs分化;最后用免疫细胞化学方法染色鉴定。结果 分离培养的细胞聚集生长，形成的克隆球可以传代;克隆球p75染色阳性;分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原。结论 分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力，表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75，是肠神经嵴干细胞。

　　【关键词】 肠神经嵴干细胞;胚胎小鼠;细胞培养;细胞分化;先天性巨结肠症

　　Isolation and culture of neural crest stem cells of embryonic mice in vitro

　　Xiao Li, Liu Yong, Gao Ya

　　(Department of Pediatric Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004; the Key Laboratory of Environment and　Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To establish a satisfactory method of isolating, culturing and determining gut neural crest stem cells, which may provide theoretical basis for clinical application. Methods The guts of embryonic mice removed and dissociated were plated into serumfree DMEM/F12 medium. The mitogenfree DMEM/F12 medium supplementd with 10% fetal bovine serum was used to induce differentiation of GNCSCs. Neurospheres and their derivations were determined with immunocytochemical and immunofluorescent staning. Results Neurospheres were generated in the simplified serumfree medium. The staining results showed that enteric neurospheres were GNCSCs and could differentiate into neurons, glial cells and smooth muscle cells by seruminduction. Conclusion GNCSCs have the capacity of selfrenewal and proliferation, and give rise to neurons, glial cells and myofibroblasts.

　　KEY WORDS: gut neural crest stem cell; embryonic mouse; cell culture; cell differentiation; hirschsprung disease

　　先天性巨结肠症(hirschsprung disease, HSCR)是小儿常见的先天性消化道畸形之一，表现为肌间神经节和黏膜下神经节的节细胞缺如。传统手术以及近年推广的新生儿、婴儿Ⅰ期经肛门根治术或腹腔镜根治术虽然提高了巨结肠的治疗效果，但其术后的并发症严重影响患儿的生活质量[1]，因此迫切需要探寻一种创伤小、远期效果更好的新型治疗方法。在本研究中我们通过细胞培养和免疫组织化学方法来研究胚胎肠神经嵴干细胞(GNCSCs)的生理特性及其分化功能，旨在将其用于临床治疗先天性巨结肠症。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验动物 怀孕14-17d昆明小白鼠10只，体重不拘，第四军医大学实验动物中心提供。

　　1.2 仪器与试剂 细胞培养主要仪器：ESPEC恒温二氧化碳培养箱和OLYMPUS倒置显微镜。DMEM/F12完全培养基(Gibco)组成：B27添加剂(Gibco)、N2添加剂(Gibco)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, vitrogen)、β巯基乙醇(Sigma)、青霉素和链霉素(华北制药)。促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加10%(体积分数)胎牛血清。其他：胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶(Sigma)、左旋多聚赖氨酸(Sigma)。一抗：兔抗小鼠NGFRp75(武汉博士德)、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)、兔抗GFAP多克隆抗体(DAKO)、鼠抗小鼠αActin单克隆抗体(Sigma)SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(博士德生物工程有限公司)。二抗：TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 细胞分离与培养 10g/L戊巴比妥腹腔麻醉怀孕14-17d的小鼠，取胎鼠肠管，清洗，剪碎，用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶先后消化肠管组织30min和10min，用含胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，机械吹打后用200目和400目的滤网过滤杂质，离心后用克隆球完全培养基调整细胞密度，以6×105个细胞/mL接种到25mL培养瓶中开始原代培养。原代孵育24h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，再孵育3d后进行传代，以6×105个细胞/mL接种到25mL培养瓶中，继续孵育40-48h后再次传代。当有细胞团块形成时以1代/1-2d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球。

　　1.3.2 克隆球的分化 用含10%(体积分数)胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35mm培养皿内，每孔2mL，动态观察克隆球的分化情况。

　　1.3.3 克隆球及其分化细胞的鉴定 采用SABC法检测p75NTR 、GFAP、Peripherin抗体，间接免疫荧光法检测αActin抗体来鉴定克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共聚焦显微镜取图。

　　2 结果

　　2.1 胚胎肠管细胞的生长状况 接种初期，倒置显微镜下观察到呈球状的单细胞和不规则的细胞团。孵育24h后，大量细胞贴壁生长，细胞呈圆形，胞体小，折光性较好，未贴壁的细胞上浮(死亡)。贴壁的细胞分两类：①细胞胞体明显增大,折光性增强,出现分裂相，形成2-5个细胞的细胞团,形成小克隆球(图1A);②细胞体积无显著变化，折光性好，逐渐呈聚集生长，主要是成纤维细胞，3d后可观察到由十几个或数十个细胞构成的克隆球逐渐增大，向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界限清晰，但克隆球中心密集，界限不清，无法观察到完整的细胞结构(图1B)。在连续传代过程中克隆球逐渐纯化，且生长速度与原代培养基本等同。

　　图1 倒置显微镜下的克隆球(略)

　　Fig.1 Enteric neurospheres observed with inverted microscope

　　A: enteric neurospheres after primary culture, 3 days in vitro (×20); B: enteric neurosphere after having been passaged (×40)

　　2.2 克隆球的分化状况 选择生长状态良好的细胞进行传代，接种于含血清培养基培养12h，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长。24h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分辨形态;48h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层，迁出的细胞形态多样。含血清培养基促分化作用下GNCSCs可分化产生多种形态的子代细胞。

　　2.3 克隆球及其分化细胞的鉴定 采用SABC和免疫荧光技术标记p75、Peripherin、GFAP、αactin抗体，染色结果阳性(图2)。p75阳性的克隆球呈圆形或椭圆形，胞浆着色为黄褐色，胞核较大，周围偶有细小的突起;Peripherin阳性细胞胞浆着色，胞体大，突起多，形态多样;GFAP阳性细胞胞体较小，根据突起的差异可分为纤维型和星型神经胶质细胞;αactin阳性的细胞呈多角形，相互交错。

　　图2 多潜能肠神经嵴干细胞及其分化的神经元、经胶质细胞和平滑肌细胞(略)

　　Fig.2 Multipotent enteric neural crest stem cells and their derivations which were neurons, glial and myofibroblasts

　　A: enteric neurospheres stained with p75 (×40);B: neurons stained with peripherin (×40); C: glial stained wit GFAP (×20); D: myofibroblasts stained with αactin (×40)

　　3 讨论

　　1992年Stemple和Ito等分别从大鼠和小鼠的神经嵴中分离出了GNCSCs，首次证明了GNCSCs的存在。Morrison 等[2]相继从胚鼠坐骨神经分离出了神经嵴干细胞，即外周神经系统干细胞，并有实验采用干细胞的特异性标志(p75NTR、GFP、Mash1、SOX10、Phox2b、RET)来研究GNCSCs增殖、凋亡、迁徙和分化等特性[36]。近年大量研究表明GNCSCs的缺乏或发育异常会导致肠神经系统发育缺陷，说明了GNCSCs在肠神经系统发生和发育过程中起关键作用[78]。

　　本实验主要依据神经干细胞经典的培养方法[9]，再结合GNCSCs“收获率”低、难以分离纯化的特点，联合应用特殊培养基和连续传代法来进行体外培养。这种用于GNCSCs体外培养的方法能有效地分离和传代GNCSCs，为进一步的研究奠定基础。

　　本实验结果表明分离培养的胚胎小鼠的GNCSCs具有较强的自我更新能力，在原代和传代培养过程中发现部分细胞能够连续传10代左右(1月左右)，具有形成克隆的能力。克隆球的部分细胞不可避免地死亡和分化(可能为祖细胞和成熟细胞)，但仍有细胞具有克隆能力。采用连续传代的方法不仅能纯化GNCSCs，还能证明子代细胞保持亲代细胞的干细胞属性。另外在原代培养中发现，若没有及时传代，克隆球将迁移、变形并伸出突起，这一现象提示即使在细胞因子存在的条件下，神经干细胞也可以发生分化，说明生长因子不仅有促进增殖的作用，也有促进分化的效果[1011]。

　　GNCSCs在除去生长因子的含血清培养基中很快贴壁分化，有大量的分化细胞从中迁出。迁移出来的细胞形态多样，具有典型神经元和神经胶质细胞的形态特征。用神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞的特异性标记进行免疫染色，证明了GNCSCs能分化出正常肠神经系统中的细胞类型，说明GNCSCs在体外具有多向分化的能力。综上所述，若能在体外调控GNCSCs的分化方向，将必然会深刻影响GNCSCs的临床应用。

　　虽然GNCSCs的研究目前还处于初级阶段，但GNCSCs的分离培养成功为其深入开发和应用奠定基础，不仅为临床应用中可能遇到的取材、分离及体外培养技术的困难积累经验，也为应用肠神经嵴干细胞替代疗法提高HSCR的治愈率提供了实验依据。首先在GNCSCs基础研究方面，它会成为研究肠神经系统“干细胞性”疾病病因学的重要对象，为解决胃肠道动力性疾病开辟新思路。其次在临床研究方面，随着GNCSCs研究的深入和基础理论的完善，为先天性巨结肠治疗方法的改进和创新提供新的启示。设想从患者正常的肠壁内分离培养出GNCSCs，在体外诱导分化并回植到患者病变肠段，在合适的肠道微环境下分化出具有一定功能的神经元，这些神经元相互之间可以形成相应的突触连接，重建具有一定结构和功能的肠神经系统。

　　【参考文献】

　　[1]Langer GC. Hirschsprung disease [J]. Curr Probl Surg, 2004, 41:949988.

　　[2]Morrison SJ, White PM, Zock C, et al. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo selfrenewal of multipotent mammalian neural crest stem cells [J]. Cell, 1999, 96:73749.

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　　[10]Ciccolini F, Svendsen CN. Fibroblast growth factor 2 promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF2 [J]. J Neurosci, 1998, 18(19):78697880.

　　[11]Shihabuddin LS, Ray J, Gage FH. FGF2 is sufficient to isolate progenitors found in the adult mammalian spinal cord [J]. Exp Neurol, 1997, 148(2):577586.