原花青素对Aβ2535诱导PC12细胞周期紊乱的保护作用

　　作者：谢朝阳,梅寒芳,祝其锋,吴斌华,陈小芳　　作者单位：广东医学院检验医学研究所，广东 湛江 524023

　　【摘要】目的观察原花青素(PAC)对β淀粉样肽(2535) (Aβ2535)诱导体外血清饥饿培养的PC12细胞周期紊乱与凋亡的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法 采用血清饥饿培养使PC12细胞同步于G0期，PAC预处理后加入Aβ2535，通过流式细胞仪分析细胞周期与凋亡，RTPCR和Western印迹从mRNA及蛋白水平检测p21、Cyclin D1、pRb和E2F1基因表达的变化。结果 与Aβ2535诱导组比较，PAC保护组S期细胞百分率明显减少，凋亡率明显降低(P<0.05);p21 mRNA和蛋白表达增加(P<0.05)，Cyclin D1、E2F1 mRNA和Cyclin D1、pRb蛋白表达降低(P<0.05)。结论 PAC对Aβ2535诱导的PC12细胞周期紊乱与凋亡起保护作用，其机制可能与上调p21表达，下调Cyclin D1、pRb、E2F1表达有关。

　　【关键词】 原花青素;Aβ2535;PC12细胞;细胞周期;基因表达

　　【Abstract】 Objective To observe the protective effects of Proanthocyanidins(PAC) on abnormal cell cycle in PC12 cells induced by βamyloid peptide 2535(Aβ25～35)and study its possible mechanisms. Methods PC12 cells were synchronized by 24 h serum deprivation, pretreated with PAC for 1 h，and then Aβ25～35 for 0～24 h. The changes of cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry. Protein and mRNA expressions of p21，Cyclin D1，pRb and E2F1 were detected by RTPCR and Westernblot respectively. Results Compared with those in Aβ25～35 group, the percent of S phase cells and apoptotic rate were decreased remarkably (P<0.05) in PAC group, the mRNA and protein expressions of p21 gene were increased，and the expressions of Cyclin D1，pRb and E2F1 gene were decreased(P<0.05). Conclusions PAC has protective effects of redistribution of cell cycle and apoptosis in serumdeprived PC12 cells induced by Aβ25～35, which is related with upregulating p21 expression, and downregulating Cyclin D1，pRb and E2F1 gene expressions.

　　【Key words】 Proanthocyanidins;Aβ25～35;PC12 cell;Cell cycle;Gene expression

　　研究表明原花青素(PAC)不仅具有促进肿瘤细胞凋亡〔1〕、清除自由基和抗氧化应激〔2〕、改善免疫抑制〔3〕等作用，还能提高多种细胞的增殖活性〔4〕。阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD) 是一种老年神经系统退行性疾病，病因十分复杂。近年研究表明AD病理变化可能与细胞周期调控紊乱有关。本课题组的研究也表明，β淀粉样肽(Aβ)2535诱导血清饥饿培养PC12细胞周期紊乱、凋亡，伴有细胞周期相关蛋白表达异常〔5〕，而PAC可剂量依赖性对抗Aβ2535对PC12 细胞的毒性作用，增加PC12细胞的存活率〔6〕。本实验以已建立的Aβ2535诱导血清饥饿培养PC12细胞为受损神经元模型，进一步研究PAC对受损神经元的保护作用是否与细胞周期调控有关。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 PC12细胞由军事医学科学院基础医学研究所马子敏博士惠赠;Aβ2535购于Sigma公司(用PBS配制);DMEM及马血清均购自Gibco公司;P21、Cyclin D1小鼠抗大鼠单克隆抗体、pRb(Ser780)兔抗大鼠多克隆抗体、ECL试剂为Santa Cruz公司产品;RTPCR试剂盒为大连宝生物工程公司产品;胎牛血清为杭州四季青公司产品;琼脂糖为Amresco公司产品;各种规格培养皿均为美国Corning Costar公司产品;引物为上海生物工程公司合成。PAC购自南京学子医化研发中心，为葡萄籽提取物，质量分数大于95%，用DMSO溶解配成贮存液，DMSO终浓度<0.1%(V/V);其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 方法见参考文献〔5〕。

　　1.2.2 血清饥饿法处理PC12细胞 将对数期生长的PC12细胞以各实验所需细胞数接种于培养板或培养瓶中，24 h贴壁后，按常用的血清饥饿法，使细胞同步化于G0期。即：吸出原培养液，用DHanks液洗2次，换成无血清DMEM孵育24 h，使细胞静止于G0/G1期。按照下述方法进行实验。

　　1.2.3 药物处理及分组 取同步化PC12细胞，用终浓度30 mg/L的PAC 预处理1 h，再加25 μmol/L Aβ2535，继续培养至所需时间，收集细胞进行实验。每次实验均分空白对照组(0 μmol/L Aβ2535)、Aβ2535诱导组及药物保护组(PAC + Aβ2535)。

　　1.2.4 流式细胞术检测 取对数生长期的PC12细胞以3×108个/L接种于6孔板，每孔加2 ml培养，药物保护组加入终浓度为30 mg/L PAC预处理1 h，再与诱导组同时加入终浓度为25 μmol/L Aβ2535，继续培养24 h，收集细胞至1.5 ml EP管中，PBS洗2次，800 r/min离心10 min，70%乙醇-20℃固定过夜，用PBS洗1次，1 200 r/min离心10 min，每管加PI至终浓度为50 mg/L，37℃避光孵育30 min，过滤后上机检测。每个样品计数10 000个细胞，每组重复3次取平均值。

　　1.2.5 RTPCR检测p21、Cyclin D1、E2F1基因mRNA表达 将对数期生长的PC12细胞以2×108个/L接种于6孔板，每孔加2 ml培养24 h，加入30 mg/L的PAC预处理1 h，再加25 μmol/L Aβ2535，继续培养4、8、20 h，按Trizol试剂盒说明抽提总RNA。引物序列：①鼠p21WAF1：正义：5′CCGTGGACAGTGAGCAGTT3′，反义：5′GGCGCTTCCAGTGATAGAA3′(扩增产物399 bp);②鼠Cyclin D1：正义：5′GCGTACCCTGACACCAATCT3′，反义：5′GAACCGGTCCAGGTAGTTCA3′(扩增产物219 bp);③鼠E2F1：正义：5′GTGCAGAAACGACGCATCTA3′，反义：5′CTCAGGGCACAGGAAAACAT3′(扩增产物417 bp);④鼠 GAPDH：正义：5′GGTGAAGGTCGGTGTCAACG3′，反义：5′GAGCCCTTCCACGATGCCAA3′(扩增产物517 bp，为内参照)。RTPCR：按宝生物试剂盒操作。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。用Bandscan图像分析软件进行光密度积分值分析，计算目的基因与GADPH(内参照)的光密度积分值之比作为各目的基因mRNA的相对含量值。

　　1.2.6 Western印迹检测p21、Cyclin D1、pRb蛋白的表达 将对数期生长的PC12细胞以2×108个/L接种于6孔板，培养24 h，加入30 mg/L的PAC预处理1 h，再加25 μmol/L Aβ2535，继续培养4、8、20 h，收集细胞冷PBS洗涤2次，然后溶解于250 μl细胞裂解液(50 mmol/L TrisHCl， 150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA pH8.0，1%NP40，0.05% PMSF，2 μg/ml Aprotinin，0.5 μg/ml Leupeptin)，提取蛋白。蛋白定量采用Bradford法，12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿电转移法转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入用封闭液稀释的一抗p21、Cyclin D1(1∶200)、pRb和βactin(1∶400)，室温结合2 h，洗膜后加入适量二抗稀释液(P21、Cyclin D1、βactin 1∶5 000;pRb 1∶8 000)，反应1.5 h。化学发光法显色，X射线胶片曝光，扫描保存。用Bandscan图像分析软件进行光密度积分值分析，计算目的蛋白与βactin(内参照)的光密度积分值之比作为各目的基因蛋白的相对含量值。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件包完成。实验数据用x±s表示，数据处理采用单因素方差分析，两组间比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 流式细胞术结果 流式细胞仪检测可见，药物保护组S期百分率与诱导组比较明显减低(P<0.05)，与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);细胞凋亡率较诱导组明显减低(P<0.05)，而与空白对照组PC12细胞自然凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

　　2.2 PAC增加p21 mRNA表达，降低Cyclin D1和E2F1 mRNA表达 RTPCR结果显示，对照组p21、Cyclin D1和E2F1 mRNA表达量分别为0.61±0.02、0.97±0.07、0.29±0.01。诱导组P21 mRNA表达于4 h降低，Cyclin D1和E2F1 mRNA表达于4 h增高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);而药物保护组p21 mRNA表达于8 h增加，Cyclin D1和E2F1 mRNA表达于8 h减少，与诱导组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2。表1 PAC对Aβ2535诱导PC12细胞凋亡率及周期分布的影响与空白对照组比较：1)P<0.05;与诱导组比较：2)P<0.05

　　2.3 PAC增加p21蛋白表达，降低Cyclin D1和pRb蛋白表达 Western印迹结果显示，对照组p21、Cyclin D1和pRb蛋白表达分别为0.22±0.01、0.21±0.02和0.34±0.02。诱导组p21蛋白表达4 h开始降低，Cyclin D1和pRb蛋白表达于4 h增高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05);而药物保护组p21蛋白表达8 h开始增加，pRb蛋白表达于8 h减少，Cyclin D1蛋白表达于20 h减少，与诱导组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表3。表2 PAC对Aβ2535诱导的PC12细胞周期相关基因mRNA表达的影响与对照组比较：1)P<0.05，与同时间点诱导组比较：2)P<0.05，下表同表3 PAC对Aβ2535诱导的PC12细胞周期相关基因蛋白表达的影响

　　3 讨 论

　　PAC是广泛存在于水果、蔬菜、种籽、花朵和树皮中的一种天然化合物，由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，分二聚体、三聚体直至十聚体。其中葡萄籽尤其富含PAC单体儿茶酚的二聚体、三聚体和高聚体。国内外研究毛里求斯茶叶PAC抗氧化作用时，应用TEAC (trolox equivalent antioxidantcapacity) 法和FRAP (the ferric reducing antioxidant power) 法发现红茶鲜叶中PAC抗氧化作用的R值分别是0.96、0.95〔7〕，表明PAC有较强的抗氧化作用。Yance等〔8〕研究显示葡萄籽原花青素提取物(GSPE)可抑制肿瘤坏死因子(TNF)α诱导的血管内皮生长因子(VEGF)的表达,用GSPE饲养肿瘤移植鼠能通过减少VEGF的分泌来抑制肿瘤内微脉管系统的形成，从而抑制肿瘤的转移。Ma等〔9〕研究发现GSPE能有效抑制细胞炎性因子的表达,从而通过活化PPARγ的表达和抑制RAGE的表达来保护内皮细胞的功能。唐瑛等〔10〕研究葡萄籽原花青(GSP)对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠原代培养海马细胞氧化损伤凋亡的影响，结果表明GSP对H2O2诱导的海马神经细胞凋亡具有保护作用。本实验提示PAC对Aβ2535诱导PC12细胞凋亡有保护作用，表明PAC对受损脑部神经元有保护作用。本实验中流式细胞仪检测结果显示，去血清培养PC12细胞24 h，大约90%的PC12细胞停留在G0/G1期。用Aβ2535处理去血清培养PC12细胞，发现G0/G1期细胞明显减少，S期百分率明显增高，并出现凋亡峰，PAC保护组S期细胞百分率明显降低，与Aβ2535诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);凋亡率比诱导组减低，差异有统计学意义(P<0.05)，G0/G1期前的亚二倍体峰消失。表明PAC对 Aβ2535诱导细胞凋亡的保护作用，可能与调控细胞周期分布作用有关。

　　p21作为细胞周期的负调控因子，与Cyclin/CDK4或Cyclin /CDK6复合物结合，控制CDK的激活从而调控细胞周期各时期的转换。Sala等〔11〕研究表明HMG辅酶A还原酶抑制剂simvastatin调控AD患者淋巴母细胞进入细胞增殖状态可能与抑制蛋白酶体介导的下调p21和p27的表达有关。可见p21在维持分化状态的细胞中起重要的作用。已知Cyclin D1/CDK4为调控G1/S的一个关键的调控子。但Lu等〔12〕认为Cyclin D/CDK4是调控G0/G1的关键因素，Cyclin D1/CDK4被激活，神经细胞会离开G0期重新进入细胞周期。本实验结果显示，PAC药物保护组8 h开始上调p21基因的表达，与Aβ2535处理组比较，差异有统计学意义(P<0.05);与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。同时PAC药物保护组下调p21下游元件Cyclin D1的表达，与诱导组同时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)。结合流式结果分析PAC上调p21的表达，抑制Cyclin D1的表达，使Aβ2535诱导的PC12细胞从细胞周期S期退出，重新定位于G0/G1期。Cyclin D1低表达，使其底物pRb与其下游的转录因子E2F1维持结合状态，抑制E2F1的活性而阻止细胞进入S期。Chong等〔13〕用Rb上游元件抑制剂抑制Rb过度磷酸化，以维持E2F1/Rb复合物的完整性，神经元的凋亡得到保护。本实验结果表明，PAC保护组8 h E2F1 mRNA和pRb蛋白表达下调，与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。提示PAC可能通过上调p21基因的表达，抑制Cyclin D1的激活，减少pRb的磷酸化，从而降低E2F1的表达，对Aβ2535诱导的PC12细胞周期紊乱起保护作用。

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