肝细胞肝癌中Hedgehog信号通路效应蛋白的功能分析

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的最主要类型。HCC'恶性度高，预后差。每年有七十万左右的新发病例，其中约有一半发生在中国。其死亡率居恶性肿瘤的第2位。因此，改善肝细胞癌诊断和顶后具有重要意义。分子生物学研究显示，与胚胎正常发育密切相关的信号通路在多种肿瘤中被激活川o Hh(Hedgehog)信号通路是一种经典的胚胎发育和分化信号转导系统，控制着细胞的生长、增殖与分化。Hh通路不仅在胚胎正常发育中起着重要作用，Hh通路的异常还可引发畸形和肿瘤ua-u Gli蛋白是Hh信号通路下游具有锌指结构域的转录因子。研究显示，Gli功能异常可导致细胞增生分化降低，组织器官发育缺陷，提示G1i可能与各种类型癌症的发生相关。本研究检测了肝细胞癌组织中Glil蛋白和Gli3蛋白的表达情况及相关性.并与癌旁肝组织的表达情况比较，探讨了其与肝细胞癌的临床病理特征的关系，以便为其在肝细胞癌临床诊断、治疗及预后中的应用提供依据。

资料与方法

1.一般资料:收集嘉兴医学院附属医院外科2007年1月至2012年3月手术切除并具有完整临床记录及病理资料的肝癌病理标本36例。36例中男性21例，女性15例;年龄31一7}岁，平均51.4岁。肿瘤直径1.6一13.4 cm.平均岛10px根据Edmondson-Stcine:分级标准:工一且级9例，班一W级27例。

2.肝癌组织标本:收集36例肝癌石蜡包埋样本，同时收集相应癌旁肝组织样本(距离肝癌肿块边缘>5 cm)0 36例肝细胞癌患者术前均未接受过化疗或放疗。手术标本均经组织病理学检查明确诊断，并有完整随访记录，临床资料完整。

3.主要试剂:一抗兔抗人CTlil多克隆抗体CH-300)，稀释度1}100;一抗兔抗人CT1}3多克隆抗体(H-280>,稀释度I，0，均为美国Santa Cruz公司产品。二抗EnVIS泊n.,Envision及DAIS显色试剂盒购自美国Dak。公司

4.免疫组织化学检查:采用EnVisionT}'二步法，染色步骤严格按说明书进行。将病理标本蜡块常规切片，每例病理标本连续切片2张，分别标记Ulil和(lli3a(1)切片脱蜡至蒸馏水洗;(2)3%Hz():甲醇液10 min，自来水冲洗;<3)EDTA(pH 9.0)微波修复20 min，室温冷却20 min,蒸馏水洗;(4)滴加一抗室温孵育60 min,0.O1 mol/I,PBS(pH 7.4)洗3次，每次5 min;(5)滴加二抗室温孵育30 min,PBS洗3次，每次5 min;(6)DAB显色液显色5 min，自来水冲洗，蒸馏水洗;(7)苏木精染色1 min，自来水冲洗返蓝15 min;(8)脱水，透明、中性树胶封固。

5.结果判定:由高级病理科医师采用双盲法评价免疫组织化学染色结果。以细胞质和(或)细胞核出现棕黄或棕褐颗粒为阳性细胞。普通光学显微镜下每张切片随机选取5个高倍镜视野观察细胞，分别连续计数100个细胞。根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占比例判定实验结果。按着色强度评分:未着色(<0分)、浅黄色((1分)、浅棕色(2分)和深棕色(3分)。按观察结果，即阳性细胞占总细胞的百分比评分:毛50o CO分)}}500^2500}1分),}25%一500oC2分)、>50%一7500<3分)和>7500(4分)。以着色强度评分和观察结果评分的乘积为表达程度，,2分认为是表达阳性。

6.统计学处理:采用SPSS 17.0统计分析软件包进行统计检验。计量资料采用Fisher精确概率法检验。以P簇0.05为差异有统计学意义。

结果

1.Glil和Gli3在肝细胞癌组织和癌旁肝组织中的表达:在检测的36例肝癌病理标本及相应的癌旁肝组织中，Glil蛋白在肝细胞癌组织和癌旁肝组织中的阳性表达率分别为750oC27/36)和36.1%C13/36}，两者差异具有统计学意义(PC0.05}0 Gli3蛋白在肝细胞癌组织和癌旁肝组织中的阳性表达率分别为58.3%(21j36)和30.6%<11/36)，两者差异具有统计学意义(PLO.05)o

2.Glil和Gli3与肝细胞癌临床病理指标的关系(表1、图1):Gli3蛋白在36例肝细胞癌组织中的表达与患者的临床指标(年龄、肿瘤大小、分化和淋巴结转移)无关.P值均大于0.05 o G1i1蛋白在肝细胞癌组织中的表达与患者的年龄和肿瘤大小无关，Y值均大于0.0}肝细胞癌组织中(Tlil的阳性表达率在高分化组(工一且组)中为%14.4 0 o，在低分化组(In一代组)为85.208}.2，两者差异有统计学意义(PLO.05)o淋巴结转移是肿瘤最常见的转移方式。在有淋巴结转移的肝细胞癌组织中G1il的阳性表达率为90.500，在无淋巴结转移的肝细胞癌组织中G1i1的阳性表达率为53.300，两者差异具有统计学意义(PLO.05)。

3.Gli 1表达与Gli3表达的关系(表2):对肝细胞癌组织中(}lil与Gli3的表达水平进行相关性分析，Pearson相关系数为0.423>P=0.019，显示肝细胞癌组织中(Glil和Gli3的表达水平呈正相关。

讨论

Hh<Hedgehog)信号通路是调节胚胎期组织分化发育的重要通路。Hh信号通路主要由分泌型信号糖蛋白Hh配体、跨膜蛋白受体Ptch和Sm。组成的复合物以及下游的转录因子G1i蛋白组成。Hh信号通路主要有三种核转录因子(Glil,Gli2和Gli3)，它们参与调控信号通路下游目的基因的转录水平，进而调控细胞的生长、增殖和分化l。其中Glil起激活Hh信号通路下游目的基因转录的作用，Gli3既是转录的抑制因子，同时也是潜在的转录激活因子川。研究显示，成熟的正常肝细胞不表达Hh信号通路，Hh信号通路处于关闭状态川。我们的研究显示，HCC组织中Glil的阳性表达率显著升高，肝细胞癌组织中(Glil的阳性表达率(7500)显著高于癌旁肝组织中Glil的阳性表达率(36.100)。这表明在肝细胞癌组织11h信号的活性异常增高;癌旁肝组织中也具有Glil的表达，但是处于相对较低水平。本研究进一步揭示了Glil的表达与HCC,的恶性程度有明显的关联:恶性度较低的高分化组和不伴有淋巴结转移的病例，其Glil表达率都远远低于恶性度高的低分化组和伴有淋巴结转移的病例。

Gli3是参与早期肢体发育的重要转录因子。研究证实(Gli3与指(趾)的发育密切相关，但是否与肝癌的发生有关国内外未见报道。我们的研究显示，肝细胞癌组织中Gli3的阳性表达率与癌旁肝组织中Gli3的阳性表达率具有统计学意义的差异(PCO.0}).而且在肝癌组织中Glil和(CTli3的表达水平之间具有显著的相关性(r=0.}23,P}0.05)o这表明在肝细胞癌的发生中Gl;家族共同促进细胞的生长和分化，提示我们需要将(Gli家族的三种核转录因子作为整体考虑，以期更好地理解Hh信号通路对肝细胞癌的调控作用。综上所述，Hh信号通路的异常激活在HCC的发病机制中起到了重要的作用。检测Glil表达可能作为判断肝细胞癌恶性程度及预后的指标，对HCC的早期诊断和治疗具有深远的意义。然而，由于本研究病理资料数量有限，Gli3与临床病理之间的关系仍有待进一步研究.

参考文献

[1]Ahmedin Jemal DVM,Freddie Bray.Global cancer statistics[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2011.6990.

[2]Bertrand N,Dahmane N.Sonic hedgehog signaling in forebrain development and its interactions with pathways that modify its effects[J].Trends in Cell Biology,2006,(11):597-605.doi:10.1016/j.tcb.2006.09.007.

[3]郝昆,谢学海,杨尹默.Hedgehog信号通路在胰腺癌发病机制中的研究进展[J].中华肝胆外科杂志,2011,(1):70-72.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2011.01.025.

[4]Rubin LL,de Sauvage FJ.Targeting the Hedgehog pathway in cancer[J].Nature Reviews Drug Discovery,2006.1026-1033.

[5]胡伟国,宋启斌,姚颐.Sonic hedgehog和p连环蛋白在胰腺癌组织中的表达及其相关性研究[J].中华肝胆外科杂志,2010,(3):179-183.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2010.03.007.

[6]Ruizi Ahaba A,Sanchez P,Dahmane N.Gli and hedgehog in cancer:tumours,embryos and stem cells[J].Nature Reviews Cancer,2002.361-372.

[7]Lum L,Beachy PA.The hedgedog response network:sensors,switches,and muters[J].Science,2004.1755-1759.

[8]Bai CB,Stephen D,Joyner AL.All mouse vent ral spinal cord patterning by hedgehog is Gli dependent and involves an activator function of Gli3[J].Developmental Cell,2004.103-115.

[9]Cai Y,Zheng H,Gong W.The role of hedgehog signaling pathway in liver regeneration[J].Hepato-Gastroenterology,2011.2071-2076.