小肠旋毛虫感染对结肠黏膜表皮钙黏附素的影响及机制研究

肠上皮细胞的完整性是保持肠道屏障，调节养分和水分的吸收，限制摄取肠腔内细菌和细菌产物的必需因素‘。肠上皮的屏障功能主要由根尖交界的紧密连接来保持，其中包括几个不同的结构被称为紧密连接、豁附连接、桥粒和缝隙连接。紧密连接(TJ)主要是一个多细胞屏障。勃附交界处形成一个连续的的带、对维护细胞间豁附起着关键的作用2-3。紧密连接和粼附连接通过跨膜TJ-}J蛋白质之间的相互作用来进行调节2。主要跨膜蛋白包括。ccludin,claudins、结合瓤附分子和表皮钙孰附素(E-cadherin)。有研究发现，感染线虫Nippostrongylu、会引起肠道E-cadheri。的表达改变，导致小肠上皮细胞的附着力损失，多形螺旋线虫H.poiygyru:感染导致小肠戮膜通透性增加5-6。目前还不清楚旋毛虫感染如何影响结肠的屏障功能在本研究中，我们旨在观察小肠旋毛虫T.spirali、感染对结肠上皮的屏障功能的影响资料与方法一、实验动物及分组6}8周龄雌性BALB/c'小鼠10只，体质量(18.912.1)g SPF级，以高压蒸汽消毒的食物和水喂养。分为T.spirali、感染组和无感染的对照组各5只。6}8周龄雌性S'I'AT6基因敲除(TH2缺乏)的STAT6-/-小鼠10只，体质量(18.111.9)g分为T.s p ir(Z}i、感染组和无感染的对照组各5只。感染组每只小鼠经口服接种T.spiralis 400条。

二、材料辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)购自美国Sigma公司。CD3单克隆抗体和TRIzoI购自美国Gibc"。公司。小鼠IL-4的实时PCR探针和引物购自美国Biosource International公司。E-cadherin抗体购自美国ZYI}IED公司。

三、实验方法

1.结肠通透性检测:小鼠感染7d后，禁食I2 h,以2%戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg),50浏辣根过氧化物酶(含0.6 mg HRP)以针头经直肠给药;灌注O,fO和120 min后，从尾静脉收集血液样本，采用ELISA法测定血清HRP浓度，通过测量小鼠血液中HRP的浓度来判定结肠通透性。

2.淋巴细胞细胞因子的检测:感染7d后，所有小鼠经断颈法处死。打开腹腔，取出肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)和结肠。将外周淋巴结分组研磨(研磨液为cDMEM)，用70 N.,m的滤器过滤沐进行离心，离心条川为40C,1500 r/min,8 min。离心后弃除上清，加人2 ml cDMEM溶液，将细胞震荡溶解取出1 x 10个细胞，将之调成5x106细胞/ml cDMEM二以CD3单克隆抗体孵育，置于C0}培养箱内，5%CO=,37℃静置培养。72 h后，收集培养液上清。置于一200C冻存以ELISA法检测IL-4的表达量

3.免疫荧光显微镜:结肠组织以包埋剂包埋冰冻，低温恒温切片机切成5}.,t m的薄片，然后以丙酮固定用PBS冲洗，并用PBS-1%BSA和抗生物素蛋白/生物素阻断剂孵育，然后加人50闪一抗E-cadherin孵育于4 0C孵育过夜后，加人50闪荧光标记的二抗孵育切片，免疫荧光显微镜检查。

4.上皮细胞的分离:小鼠结肠组织以37℃汉克斯缓冲液(含有30 mmol/L的EDTA)冲洗5 min。纵向切开组织，HBSS平衡盐冲洗溶液(含有2%小牛血清)漂洗将结肠切成1 cm的碎片，放人冰HESS平衡盐冲洗溶液中，37℃持续剧烈震荡30 min。摇匀后，回收上清液，以100 p.,m的细胞过滤器过滤。4 0C,3000 r/min离心10 min。以20 rnl冰汉克斯缓冲液漂洗离心后下沉的颗粒2次，然后以细胞裂解液溶解。5.western blot检测E-cadherin蛋白:制备结肠上皮细胞裂解液，使用BCA蛋白测定法测定蛋白质含量。细胞裂解液与样品缓冲液混合，通过标准预制凝胶分离蛋白，并转移到硝酸纤维素膜。使用鼠抗E-cadherin的抗体进行Western blot检测。斑点是相应的HRP标记的二抗的化学发光:y-GAPDH作为蛋白表达分析内部对照。E-cadherin条带的密度以每一个组y-GAPDH作为标准。

四、统计学方法实验数据采用x1s表示。采用GraphPad Prism统计学软件进行统计分析。计量资料的比较采用t检验结果一、小鼠结肠通透性的改变ELISA检测显示，灌注60和I 20 min后，BALB/c小鼠对照组血清含少量HRP，而感染组小鼠血清HRP水平显著增高(P<0.05;而STATE-/-小鼠感染组和对照组血清HRP水}}}r-}G统i"f"意义(P0.05;STATE-/-小鼠感染组HRP水平略高于B.ALB/c感染组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1

二、小鼠的结肠上皮细胞E-cadherin的分布情况免疫荧光染色显示:BALB/c对照组小鼠结肠上皮细胞中，E-cadherin蛋白主要定位于细胞膜，绿色荧光带非常锐利，见图2a;而感染组E-cadherin多数位于细胞质中，绿色荧光带则较为模糊，见图2b}STATE-/-小鼠对照组和感染组E-cadherin蛋白分布变化不明显。见图20和图2d

三、小鼠肠上皮细胞E-cadherin蛋白的表达J清况Western blot检测显示:B ALB/c感染组小鼠结肠上皮细胞E-cadherin表达水平较对照组明显减少(P<0.05;而在STAT6-/一小鼠中，感染组结肠上皮细胞E-cadherin表达水平与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3}四、NI LIV细胞因子IL-4检测结果ELISA检测结果显示，BALB/c小鼠对照组IL-4为(21.0士2.3林g/L，明显低于感染组的(193.0士12.5)},g/L(P<0.05);STAT6-/-小鼠对照组IL-4为(3.0士1.2)林g/L，感染组为(15.0士3.1)}g/L,B ALB/c感染组IL-4表达水平明显高于STAT6-/-感染组(P<0.05。见图4

讨论

以往的研究表明，肠道寄生虫感染明显影响了肠道上皮的功能例如，N.brasilien,si、感染诱导了小肠上皮细胞附着力的减少，T.s p irali.、感染导致了空肠细胞周围通透性增加，H.poly}rLc、感染导致r小肠载膜通透性增加，。通过大分子HRP标记探针来评估就膜的通透性，这种技术已广泛用于测量通过肠上皮细胞运输能力s。我们发现，T.spiralis感染显著影响了上皮细胞通过细胞的转运能力。在本研究中，我们通过直接检测小鼠血清HRP水平评估肠载膜通透性，结果显示，BALB/c小鼠在感染T.spirali,、后血清HRP水平较对照组显著增加.而STATE敲除小鼠感染组和对照组的血清HRP水平差异无统计学意义。

这些结果表明，肠道寄生虫引起的结肠上皮渗透性增加可能是STATE途径依赖的在野生型BALB/c小鼠中，小肠T.s川ral is感染能够改变就膜屏障功能，并导致结肠上皮通透性增加我们首次发现，T.s p iralis感染改变了细胞间连接蛋白E-cadherin在结肠上皮的分布，导致上皮屏障受损Western blot实验结果表明，T spiralis感染导致BALB/c小鼠结肠组织中E-cadherin表达水平下降;同时，结肠组织中E-cadherin的蛋自的分布和丰度也会受到影响这可能是造成结肠上皮细胞之间连接的破坏，导致结肠屏障通透性增加的原因-肠薪膜上皮细胞通透性取决于细胞间的紧密连接，这些紧密连接是通过免疫和病原微生物刺激来进行调节的9。

肠道T spirali、寄生地点主要是在小肠，而我们观察的是结肠卜皮屏障功能的影响因此T.,s p irali、对结肠屏障的直接损伤作用极小，它对结肠}}t膜屏障的作用主要是通过免疫调节来进行的、在本研究中，B ALB/c小鼠组 7 T.spirali、感染明显改变了小鼠结肠瓤膜屏障的通透性，而TH2缺陷的STATE基因敲除小鼠小肠蠕虫感染并没有影响肠上皮屏障功能。这些结果表明，Th2细胞的活化在肠道蠕虫感染改变肠道屏障过程中起着一定的作用Th2细胞因子IL-4和IL-13能够通过STATE或磷酸肌醇3一激酶(PI3 K)途径影响他们的靶细胞的激活。此前，Ceponis等u>使用T84细胞(人类结肠土皮细胞模型)研究IL-4和II,-l3参与调节的上皮通透性的信号转导通路，认为PI3 K是IL-4和II,-13调节跨上皮电阻(TER)的主要近端信号途径。最近的研究表明，TH2(IL-13依赖的屏障调控并不需要PI3 K参与，但可能涉及STATE,IL-13作为STATE的抑制剂，不能抑制PI3K，但能避免IL-13诱导的TER损失。

我们的研究显示，7几、p irali.s感染在STATE基因敲除小鼠中未能改变结肠上皮通透性，这个结果支持了蠕虫感染时会影响STATE途径在肠上皮屏障功能调节过程中的作用。此外，我们研究结果显示，STATE-/-小鼠血清HRP水平略高于未感染的B_4LB/c小鼠;同时，未感染的STAT6-/一小鼠结肠上皮细胞中E-cadherin的表达也低于未感染的BALB/c小鼠。这表明，未感染的STAT6-/一小鼠结肠通透性可能与结肠上皮细胞E-cadherin的表达降低有关。这些结果进一步支持了E-cadherin在维护肠道通透性中的作用，并提T STATE信号通路和/或Th2免疫反应在调节肠道E-cadherin功能中起了一定的作用。

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