微孔板化学发光酶免疫分析法定量检测基质金属蛋白酶抑制剂-Ⅰ的方法研究

基质金属蛋白酶抑制剂I(tissueinhibitorofmetalloproteinasesI,TIMPI)除少量源于肝细胞外，大部分源于肝星状细胞(HSC)和枯否细胞(Kupffercell)。正常情况下TIMPI与基质金属蛋白酶(MMPs)平衡分泌，在组织不表达或仅中微量表达。　　近年的研究表明TIMPI与肿瘤等众多疾病的发生和发展存在着密切的关系。肝纤维化发生时，由于各种细胞因子的刺激，HSC大量活化，相应的TIMPI的分泌量比正常高出几倍。目前研究发现，在肝损伤的早期TIMPI明显增加，并认为它是重要的肝纤维化促进因子，且TIMPI表达量反映肝纤维化的严重程度。因此，TIMPI在肝纤维化方面具有一定的诊断价值。　　化学发光免疫分析法(chemiluminescence enzymeimmunoassay,CLEIA)具有特异性强、灵敏度高、无放射性污染、操作快速简便及易于自动化等优点，已广泛用于免疫检测中。我们利用在既往的研究中获得的TIMPI的融合蛋白和单克隆抗体，采用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)催化鲁米诺一过氧化氢化学发光体系，通过对各种免疫反应条件的优化建立了人血清TIMPI的CLEIA，并对其进行了方法学评价。　　对象与方法　　1.1研究对象随机选取60例解放军第三医院确诊为肝纤维化的患者血清，其中男性38例，女性22例，年龄23一70岁，所有血清标本分离后一80℃冻存。　　1.2仪器化学发光检测仪为北京滨松光子技术有限公司BHP9507型，酶标仪为美国Thermo LabsystemsMK3型。　　1.3试剂鲁米诺、HRP购自美国Sigma公司，其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司，人TIMPIELISA检测试剂盒购自美国R&D公司，TIMPI重组蛋白及单抗为本课题组制备。　　1.4方法　　1.4.1 TIMPI单抗的标记:应用改良过的碘酸盐氧化法，用HRP对TIMPI单克隆抗体进行标记，并保持单抗的免疫反应活性和酶的催化活性。　　1.4.2 TIMPICLEIA检测方法的建立:经过抗体的包被、加样、洗板、加二抗、洗板、加底物、上机读数等一系列步骤完成检测方法的建立，反应条件、标准品及反应液配制根据参考文献介绍方法，进行调整优化。　　1.4.3 TIMPICLEIA检测方法的性能评估:对检测方法的标准曲线与灵敏度、特异性、精密度、准确、健全性、稳定性按参考文献所述方法进行评估。　　1.4.4比对实验:对60例肝纤维化患者血清，应用CLEIA和ELISA方法同时进行检测，并对其相关性进行统计分析。　　1.5统计学方法所有数据应用SPSS13.0软件进行统计分析。　　2结果　　2.1TIMPICLEIA检测方法各种反应条件的确定应用棋盘阵列的方法经过反复优化，最终确定了如下反应条件，(1)选用牛血清作为配置标准品的基质;(2)以抗体浓度为5N.,g/ml碳酸盐缓冲液和1.5%牛血清白蛋白(BSA)，分别对微孔板进行包被和封闭;(3)酶稀释度最终选定为1:1000;(4)温育条件最终选择室温(250C)1h;(5)检测时间确定为，加人发光底物液避光反应10min后。　　2.2TIMPICLEIA检测方法性能评估结果　　2.2.1标准曲线的确定:以相对发光强度(均对TIMPI浓度(X)做双对数图，得到校准曲线回归方程为1gY=3.460+0.9161gX,r=0.99602.2.2线性范围:对高值样本进行系列稀释，重复测定10次，确定检测线性范围为0.22一12.21ng/mlo2.2.3灵敏度:经过5次重复测定，检测结果计算后最低检出限为0.12ng/mlo2.2.4特异性:选择透明质酸、层豁连蛋白、W胶原和前IQ型胶原等4种人血清中共存的常见肝纤维化标志物，分别以高于各个指标血清浓度正常值10-100倍浓度加标，检测值均低于最低检测限(0.12ng/ml)，确定与TIMPI无交叉反应。　　2.2.5精密度:以高、中、低浓度质控血清，8孔平行进行10次重复测定，得出每次浓度值的批内和多次分析的批间变异，其相对标准偏差均小于<10%。　　2.2.6准确性:选择临床TIMPI检测值低于下限的血清，分别加人0.2.6,12ng/ml的校准品，重复5次检测后计算，回收率分别为106.5%,96.5%和100.6%。　　2.2.7稳定性:将各种反应物分别置于4℃和370C，在3,5,7d后进行检测，结果进行统计分析后显示相关系数均>0.98，标准偏差均<6%。　　2.2.8健全性:用零标准品血清系列稀释高浓度定值血清(12ng/m1)，然后进行检测，用理论值和实际检测值做线性回归分析，:二0.9892，表明健全性良好。　　2.3比对实验结果检测进行配对资料t检验后，二者差异不具有统计学意义。(t=0.361,P=0.82>0.O5)。　　3讨论　　多种病因(如病毒性、酒精性、化学性、代谢性等因素)引发的肝脏损害和炎症，进而导致肝脏纤维化，表现为结缔组织广泛增生和沉积，其本质是肝脏对各种损害的一种愈合反应。在慢性肝病患者和肝纤维化的动物模型中，TIMPI呈现高表达，在慢性肝炎、胆道闭锁、肝移植患者和肝脏自身免疫性肝病(包括自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎)患者肝脏中也存在TIMPI表达的显著增高，并且其血清含量与纤维化程度相关。　　因此，TIMPI已被认为是一种肝纤维化的标志物。而目前尚未有国产的检测试剂。微孔板化学发光酶免疫分析法的原理基本与ELISA方法一致，只是将原有的底物显色更换为HZp2_鲁米诺(Iuminol)发光体系。鲁米诺，又名发光氨，化学名为3-氨基邻苯二甲酞腆，常温下是一种黄色晶体或者米黄色粉末，是一种比较稳定的人工合成的有机化合物，其在碱性条件下是以单阴离子的形式存在，当体系内加人H202和HRP后，HZOZ及其中间过氧化氢阴离子、HRP中的Fe3十即与鲁米诺反应形成不稳定的中间体，该中间体是一种内过氧化物，此内过氧化物迅速衰变成一电子激发态的氨基酞酸盐阴离子，继而发出光束，其最大光强度产生于425nm。因为操作步骤基本与ELISA相同，结果检测时只需将酶标仪换为化学发光仪，并且该方法的灵敏度与特异性也要高于ELISA方法，因此较适于在国内推广使用。　　在本研究中，我们成功建立TIMPI的CLEIA检测方法，其各种性能指标均能满足临床检测的要求，比对实验表明该方法与进口ELISA方法等效，并且成本较低，有利于临床实验室的推广应用。　　4参考文献　　Würtz SO,Schrohl AS,Mouridsen H. TIMP-1 as a tumor marker in breast cancer-an update[J].{H}ACTA ONCOLOGICA,2008.580-590.　　Adams LA. Biomarkers of liver fibrosis[J].{H}Journal of Gastroenterology and Hepatology,2011.802-809.　　Meibodi ES,Azizi MD,Paknejad M. Development of an enhanced chemiluminescence immunoassay (CLIA) for detecting urinary albumin[J].{H}MOLECULAR BIOLOGY REPORTS,2012.10851-10858.　　J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔,黄培堂. 分子克隆实验指南,第3版[M].{H}北京:科学出版社,2002.　　辛天兵,王栩,靳辉. 微板式化学发光酶免疫分析法测定人血清中癌胚抗原[J].{H}分析化学,2008,(8):1056-1060.doi:10.3321/j.issn:0253-3820.2008.08.009.　　Ramachandran P,Iredale JP. Liver fibrosis:a bidirectional model of fibrogenesis and resolution[J].{H}QUARTERLY JOURNAL OF MEDICINE,2012.813-817.