风疹病毒E1-374糖蛋白生物活性检测及其初步应用

目前正在使用的风疹病毒(rubellavirus,RV)疫苗为减毒活疫苗，在接种人群中有恢复毒力的可能。孕妇接种此种疫苗对胎儿有很大的致畸危险性。因此需要研究安全有效的新型风疹疫苗克服上述不足。本研究构建了pGAPZecA-E1-374表达载体，表达了RVE1蛋白61-435区段(E1-374蛋白)，并加以纯化，研究了其生物学活性及免疫原性，为进一步成功研制安全有效的风疹亚单位疫苗奠定基础。1材料与方法1.1质粒与菌株质粒pGAPZaA购自美国Invitrogen公司;pBluescriptSK-E1和毕赤酵母菌GS115为本室保存;DHS。感受态细胞购自北京全式金生物有限公司。1.2实验动物8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。1.3试剂RVE1糖蛋白多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;Anti-His-HRP抗体、博来霉素(Zeocinl}M)购自美国Invitrogen公司;小鼠抗RVIgG抗体ELISA试剂盒购自美国Rapidbio公司。1.4表达载体pGAPZaA-El-374与pGAPZaA-El-374-his的构建采用PCR方法扩增具有终止子和不具有终止子的E1-374段基因。反应条件:950C，5min;95℃，1min;560C，1min;720C，1.5min，循环32次，72℃终末延伸10min。PCR产物和载体pGAPZaA经EcoRI和XbdI双酶切后连接。连接产物转化DHS。感受态细胞，博来霉素平板筛选阳性克隆。经PCR和酶切初步鉴定阳性的菌株送上海生工测序公司测序。1.5蛋白的表达、初步纯化与鉴定构建好的pGAPZaA-E1-374载体通过电转方式转人毕赤酵母GS115菌株，操作方法参照文献所述。重组酵母转化子用PCR方法鉴定，引物为载体引物(P/A)和特异性引物(S1/S2)。取鉴定阳性的酵母菌株培养上清液进行WesternBlot检测和间接免疫荧光检测，步骤参照文献所述Izl。一抗为抗RVE1蛋白多克隆抗体，二抗为HRP标记或FITC标记的山羊抗兔抗体。培养4d的1L阳性酵母菌表达上清液用25%的饱和硫酸按溶液沉淀后经电泳检测纯化结果，用BCA法依照试剂盒说明书测定总蛋白浓度，用Gre-pro软件初步估计目的蛋白纯度。1.6 动物免疫与RVIgG抗体测定取纯化浓缩的E1-374蛋白，与等量的弗氏完全佐剂混合后以腹腔注射的方式免疫8周龄BALB/c小鼠8只，免疫剂量为每只0.2ml。首次免疫1周后加强免疫，纯化的E1-374蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫3次，每次间隔1周，免疫剂量同首次免疫。最后一次免疫7天后眼球采血，4℃保存备用。PBS缓冲液免疫小鼠作为阴性对照组。采用间接ELISA方法测定RVIgG抗体，方法和结果判断参照试剂盒说明书。1.7 E1-374蛋白在间接ELISA中的应用纯化的重组蛋白以起始浓度为11},},g/ml进行倍比稀释，阳性和阴性小鼠血清(商业标准ELISA检测)作为一抗，以1:25稀释后再做倍比稀释，采用方阵滴定法确定重组抗原的包被浓度和血清的最佳工作浓度。实验结果判定参照商业标准ELISA试剂盒说明。用ELISA方法分别对标准品阳性抗血清、临界血清和阴性血清(以1:20,1:50,1:100,1:2001:400,1:1000,1:2000和1:4000稀释)进行方法的敏感性和重复性检测。2结果2.1双酶切与序列分析鉴定重组质粒pGAPZaA-E1-374和pGAPZaA一E1-374-his经EcoRI和XbaI双酶切后可见长度约3.1kb的线性载体与1.1kb的目的片段(图1);经EcoRI单酶切均可获得4.1kb的线性片段;用E1-374特异引物扩增可获得约1.1kb的PCR产物。经测序，目的片段与E1-374基因相同。2.2阳性转化子的验证线性化的空载体pGAPaA、表达质粒pGAPZcxA-E1-374和pGAPZaA-E1-374-his经过纯化后，电转化毕赤酵母菌GS11S,挑取阳性克隆，提取酵母基因组DNA后，用载体通用引物和E1-374基因扩增特异性引物进行PCR扩增，其电泳结果见图202.3E1-374蛋白的表达与鉴定WesternBlot检测显示E1-374和E1-374-his蛋白相对分子质量约为50x1030酵母免疫荧光方法检测酵母菌细胞膜上E1-374蛋白的表达，对照自然光视野，pGAPZcxA-E1-374阳性酵母菌体显现绿色荧光，阴性对照未有荧光显示。通过ProteinMolecularWeightCalculator软件分析含3个糖链的蛋白相对分子质量约为46.17x103，与纯化蛋白的相对分子质量(46.89x103)相符(图3)。通过Gelpr。软件分析，纯化蛋白的纯度为54.05%,BCA法检测的总蛋白浓度约为134mg/L，目的蛋白的表达量约为72.43mg/L。2.4免疫小鼠血清中RVIgG抗体用E1-374蛋白抗原免疫小鼠，获得抗E1-374蛋白的免疫血清。实验组小鼠血清A4s。值(1.1006土0.0068)高于阴性对照组小鼠血清A4s。值(0.2311士0.0985)尸<0.0001)，表明免疫小鼠机体产生了针对RV的抗体IgGo2.5E1-374蛋白在ELISA中的应用ELISA包被板中重组蛋白的最佳浓度为5.5},},g/ml，包被液为0.OSmol/LpH9.6碳酸盐缓冲液。最佳血清稀释度为1:100。阳性血清梯度稀释后用E1-374重组蛋白包被的ELISA方法检测阳性血清，并计算变异系数(CV)。阳性标准血清各稀释度的结果为2.04%,2.32%，5.48%，0.83%，3.95%，1.64%，0.36%，1.23%;临界血清各稀释度的结果为0.88%,9.63%，12.45%，6.75%，4.25%，1.29%，4.94%，1.36%。板内变异系数值为0.36%一12.45%，表明建立的ELISA方法具有良好的重复性。3讨论RV感染孕妇，则会导致胎儿畸形、早产或胎儿死亡。由于目前使用的风疹疫苗为减毒疫苗，存在疫苗体内毒力回复突变的可能性，严重限制了减毒疫苗在孕妇和免疫缺陷人群中的应用〔3]0本研究所选用的毕赤酵母表达系统是被广泛应用的高效真核表达系统，具有经济、高效、无毒等特J点，可用来大规模表达病毒包膜蛋白，其纯化的产物可作为免疫抗原。此外，毕赤酵母表达系统能够实现高密度发酵，提高了重组蛋白的表达量。表达载体pGAPZaA含有强启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)和。-facto:信号序列，能实现外源蛋白的高效分泌表达，且不需甲醇诱导，保证了后续工业化发酵过程的安全。相对于原核表达系统来说，酵母表达系统表达E1-374蛋白在糖链修饰等方面更接近于蛋白的真实结构。表达蛋白的相对分子质量与预测相对分子质量(含糖链为46x103)基本相符，证明毕赤酵母真核表达系统能够对E1-374蛋白进行糖基化修饰。本实验通过WesternBlot分析确定了El-374蛋白上具有抗原性位点，DNAstar7.1软件对El-374蛋白的分析进一步补充了E1-374蛋白上具有抗原位点的证据，说明E1-374蛋白可以作为RV亚单位疫苗的筛选抗原。免疫小鼠的血清通过ELISA试剂盒检测表明EI-374蛋白能够诱导小鼠产生体液免疫应答，产生了抗RVIgGoE1-374蛋白不仅具有免疫原性，而且具有免疫反应性，可以应用于检测RV抗体。本研究用酵母表达系统分泌表达的E1-374蛋白，能够作为风疹亚单位疫苗的候选蛋白，是亚单位疫苗研究的第一步，为进一步实现风疹亚单位疫苗的制备必不可少。本实验所选用的小鼠经过4次免疫后，小鼠体内产生了特异的抗RV的抗体，表明EI-374蛋白具有免疫原性，产生的抗体是否具有保护作用，还有待于进一步研究。此外，E1-374蛋白的表达量和纯度仍需进一步提高。4参考文献 Nykiforuk CL,Furukawa-Stoffer TL,Huff PW. Characterization of cDNAs encoding diacylglycerol acyltransferase from cultures of Brassica napus and sucrose-mediated induction of enzyme biosynthesis[J].{H}Biochimica et Biophysica Acta,2002.95-109.向柱方,林影,叶波. HIV-1 gp41的酵母表面展示及表达优化[J].{H}生物工程学报,2008,(4):684-689.doi:10.3321/j.issn:1000-3061.2008.04.026.Perrenoud G,Messerli F,Thierry A C. A recombinant rubella virus E1 glycoprotein as a rubella vaccine candidate[J].{H}VACCINE,2004.480-488.