戊四氮致(癎)大鼠海马神经元与星形胶质细胞间关系的超微结构观察

癫病是以反复惊厥发作为临床特点的慢性脑功能障碍性疾病。大脑部分神经元同步化放电并向一定范围扩散是惊厥发作的基础。神经元的主导作用不可动摇。越来越多的实验证明胶质细胞与神经元之间有相互交流，许多实验从电生理角度证明了神经元一胶质网络的存在。本实验通过投射电镜、免疫电镜，观察戊四氮(PTZ)点燃癫痈大鼠海马神经元与星形胶质细胞(AS)之间超微结构层面的密切联系，为神经元与胶质细胞联络找出结构基础。

1材料与方法

1.1模型制作健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只，体质量170一201g第四军医大学实验动物中心提供，实验动物许可证号:SCXK-(军)2007-007〕，随机分为2组，即隔一选二人点燃组，其余为对照组。(1)点燃组:10只，大鼠腹腔注射PTZ美国Sigma公司)阂下惊厥剂量35 m扩kg，每日重复1次，逐步诱发全身性癫痈发作。参考Racine标准，评定癫痈发作级别。0级:无反应;I级:面部抽搐、点头、奔跑;11级:阵挛;111级:肌阵挛，有后退动作;W级:全身阵挛、肌阵挛发作，伴直立位或摔倒;V级:全身强直阵挛发作，失去体位控制。凡连续出现3次W级以上发作，为完全点燃大鼠。点燃大鼠均出现不定时自发性点头、抽搐、阵挛等癫痈发作。存活3d，每天上午每只大鼠随机观察1h，记录自发性抽搐的次数确保点燃大鼠模型成功。(2)对照组大鼠5只，腹腔注射9粼L盐水，直至点燃组大鼠点燃成功，存活3d处死，即与点燃组相同时间点处死。大鼠以戊巴比妥钠}80 m郊}}i}pv深度麻醉下，经左心室用含40舒L多聚甲醛,7.5州L苦味酸和25 g/L戊二醛PBS灌注固定0.5 h，si:即取脑，用不含戊二醛的卜述固定液固定4h，置于20o g/L蔗糖2h(4℃)

1.2免疫电镜染色振动切片机冠状切片，片厚50 p.,m，切片收集于0.O1 mol/L PBS中。漂洗、液氮速冻、回温。然后一套切片人兔抗Cx43抗体(工:1000,美国Chemicon公司)4 0C卜孵育48 h，再人生物索结合的羊抗兔IgG(1:200，美国Sigma公司)，室温孵育3h后人卵白素一生物素一辣根过氧化物酶复合物(1:200,美国Sigma公司)，室温孵育3 h,最后以二氨基联苯胺(DAB)显色。终止反应后固定、脱水、浸透、包埋、聚合在体视显微镜下切取标记反应阳性部位(海马CA2或CA3区)，进行超薄切片(Reicl}ert-IVissei S;Lei-ca,Vienna,Austria，片厚50 um左了;,20 g/I醋酸铀(10 mi司、构椽酸铅双重染色，在电子显微镜(H-7100,Hitachi,Japan)一卜观察和照相。

1.3电镜结果观察点燃组和对照组随机各取10张超薄切片进行电镜(H-7100;Hitachi,Tokyo,Japan)观察。每张超薄切片于放大10 000倍镜下以隔一选一的方式拍摄10张照片，观察、计算每张照片神经兀突触数量，再以史高的放大倍数观察突触结构以及细胞间联系结构。

1.4统计学处理神经元突触数量以x+s表不，采用SPSS 10.0统计软件采用t检验作统计分析一P<0.O1为差异有统计学意义

2结果

2.1神经元的突触PTZ点燃大鼠海马突触结构较对照组大鼠增多，呈现了以兴奋性突触增加为主的特点，并r=现了数个突触相连或一个神经元有数个突触的复杂突触形式。部分一个视野下可看到8一10个突触结构。可以看到轴一轴突触，兴奋性轴一树突触(突触后膜的电子致密带明显较突触前膜厚的非对称型突触)，以及抑制性轴一树一突触(突触后膜与突触前膜的电子致密带厚度基本对称的对一称型突触)，见图1,图2a,2b;PT7,点燃大鼠海马每张放大10 000倍电镜照片突触平均数目(4.92士1.24)个，对照组大鼠突触平均数目(1.08士0.90)个，2组比较差异有统计学意义(t=8.665,P<0.001)。

2.2突触复合体大鼠海马}1S的突起，由Cx43免疫阳性物质呈絮状物所标志，伸人一个典型的化学性突触(包含突触前成分和突触后成分)，构成突触复合体，见图2c,2d

2.3细胞之间缝隙连接在相邻细胞之间，一段两侧细胞胞膜之间距离增近，胞膜电子密度对称增高，二者之间可见一层细薄的膜状结构，这3层膜状结构为细胞间缝隙连接存在于神经元轴突之间、树突之间，见图3a,310，以及AS的突起之间，见图3c,3d

2.4星形胶质细胞和神经元之间的半通道Cx43-Li半通道(Cx43-Li hemi-charnel);Cx43免疫ha性物质呈絮状物的入，可见到一段AS侧胞膜增厚、电子密度增高;对侧胞膜无电r密度增高的改变，胞质内可见囊泡，为神经兀不对称的2层膜状结构，本研究认为只显示了Cx43构成的半通道，见图3e,3f。它的对侧可以是神经元或其他的胶质细胞

3讨论

癫痈发作足由大脑部分神经兀同步化放电并向一定范围扩散血引起}1S在调整神经元同步化放电中起重要作用。胶质细胞被神经元活功激活，同时.A S的活动信号反馈于神经元，构成维持惊厥发作的兴奋性环路刺激一个AS,激活环路中其他的AS，并触发临近神经元的兴奋状态的同步化LZ一3es多数研究从电生理角度和蛋自表达改变方面阐述神经元与胶质细胞之间的相互影响，但信息交流需要一定的结构基础本实验在电镜下观察细胞间关系，从超微结构层!旬阐明神经;L与胶质细胞密切联系的形态学依据

3.1癫摘组织中神经元突触增多本实验观察到兴奋性突触增多为点燃癫摘大鼠海马超微结构的一个特点。Ulliar、等于培养神经元实验中发现，}>y一以使单个神经元的突触数目卜调约7倍，同时突触前膜和突触后膜的状态也相应改变此外，神经兀需要人5的持续存在来维持突触数量的稳定一定体外条件下，11S能够显著增加神经兀突触的数R.F11_7且.部分效应可表现为神经元兴奋性增强。本实验提示点燃癫摘大鼠海马突触数量明显增多，在超微结构层IGl提供形态学实验依据胶质细胞增生是癫响组织的病理特点之一。可能在癫晌活动时增加了突触活动的同时，胶质细胞增生在癫痛中促进了突触发牛，参与了突触可塑性改变L

3.2 AS参与突触的构成，形成复杂的信息传递结构突触复合体是aS突起伸人神经兀的突触，由突触前、后成分和胶质细胞的突起共同构成.3种成分的复合体67。突触复合体的存在得到越来越多学者承认，在癫病组织中超微结构的描述未见报道一突触复合体更有利于突触活动时，胶质细胞谷氨酸转运体或，一氨基丁酸((:A13_1)转运体的运作，并参与多种离子的转运。伴随神经递质向突触问隙的释放.1S对应的改变是胞质钙震荡{7，同时通过}5间)、一泛发达的缝隙连接，AS功能合胞体产生I司步活动,15亦叮实现长距离的通讯联系}i S参与构成突触复合体，小仅可以感知局部环路内的突触信息，}司样感知来自其他脑区的突触信息LHJ 

3.3胶质细胞缝隙连接对细胞外环境平衡和突触功能有很大的影响缝隙连接)‘一泛存在于中枢神经系统缝隙连接为细胞提供低电阻的导电途径，介导神经元的同步化放电、快速信号传递;AS通过缝隙连接形成泛的功能合胞体。冷冻蚀刻方法研究脊髓神经兀发现:突触与缝隙连接同在一个突触结构区，构成复合结构，山轴突末端、突触后膜，神经元终末胞膜特化的活性区一缝隙连接构成大部分以复合方式，少部分是单纯的电突触。缝隙连接与突触后膜的N一甲基_P_天门冬氦酸(i}MDA)受体仅距0.1 N.,m。并发现AS几个突起由缝隙连接相连，链状排列。本实验观察到111燃大鼠海马神经兀突触与胶质细胞缝隙连接近距离接触，免疫电镜下显不缝隙连接与化学性突触的密切关系，为神经元与胶质细胞的信息互动提供超微结构的实验数据新近研究显不缝隙连接对细胞外环境平衡和突触功能有很大影响。AS与神经元的交流，可以调整突触传递研究显示通过抑制Cx30和Cx43表达减少AS网络活动，从而下调了海马CAl锥体神经元的突触传递!”缝隙连接形成的网络促使细胞外谷认酸、钾的清除，从而影响神经元的兴奋性、递质释放以及突触后。一氨基经甲基恶哩内酸(AMP A)受体膜的嵌人，影响突触活动

3.4半通道发挥细胞内外信息交流的作用，影响神经元的功能以及细胞存活半通道是细胞内外离子和小分子弥散的途径二由C x43组成的AS半通道，可通过ATP,I}AD+和Glu,Ca-一介导白分泌和旁分泌信号半通道、缝隙连接受神经元活动、和[H十飞1、蛋白磷酸化等影响;反之，半通道和缝隙连接通透性的改变又影响神经元活功u3}。本实验免疫电镜下观察到0:x43-Li半通道，连接AS和含有囊泡的神经元突起，系癫摘}}织中的首次报道，可能是AS半通道对神经元影响的形态学依据直接展现。当CNS受到适度的刺激，胶质细胞活化发挥其积极的防御作用，保护和维持神经元的正常功能;强烈的损伤性刺激引起AS过度激活,A S的保护功能减弱，增加半通道的数量以及增强厂半通道的功能，使神经元损伤加剧。

研究发现海人藻酸诱导癫病大鼠，Cx30 mRNA在AS表达升高，不仅有区域性，并出现在凋亡或濒死的神经元仁钾一毛果芸香碱点燃幼鼠海马0.X32和Cx43在痈样放电后表达显著增多u钙引发的死亡信号可通过缝隙连接和半通道在细胞间和细胞内外传播。抑制缝隙连接信息交流，可限制活性分子打一散到邻近的AS，减少凋亡信号在AS网络中的扩散，使未受损组织与原发受损处相隔离。阻断缝隙连接，减少了癫痈的同步化放电、放电爆发的同时，伴随的是细胞损伤增加。这也许是机体驱除起因，随后清除不利影响的自我修整。癫痈组织中神经元兴奋以及胶质细胞活化增生，促使神经元突触的形成，胶质细胞参与突触构成，以及通过缝隙连接和半通道构成兴奋性网络，可能基于这样的结构基础，影响癫痈神经元的同步化放电，在癫病的形成和发展中发挥作用。

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