促红细胞生成素对单侧输尿管部分梗阻幼鼠肾脏水通道蛋白2表达的影响

先天性肾孟输尿管连接部不全梗阻性肾积水临床上较为常见，许多患儿肾功能发生进行性损害、肾脏水通道蛋白2(AQP2)表达下降。即使手术解除梗阻，术后-定时间内患儿仍有大量稀释尿液，容易发生水盐代谢紊乱。肾脏集合管发挥尿液浓缩稀释作用的主要功能蛋白。推测解除梗阻后短期内肾脏aQP2仍不能恢复原有水平是术后患者仍有大量稀释尿液的原因之-。许多先天性肾盂输尿管连接部不全梗阻性肾积水患儿临床诊断后首选随访观察，只有肾积水进行性加重时才选择手术治疗。文献报道促红细胞生成素(EPO)除了具有促进红细胞生成的生理功能外，还可对多种器官组织损伤发挥保护作用等5报道，EPO可预防缺血再灌注损伤所致肾脏AQP2表达下调。EPO是否可以预防单侧输尿管部分梗阻(PUUO)导致的AQP2表达下调，尚未见文献报道。木研究通过对PUUO幼鼠应用EPO探讨其预防梗阻肾脏AQP2表达下调作用二现报告如下二

1材料与方法

1.1实验动物及分组6-7周龄幼年雄性SD大鼠24只(河南省实验动物中心，批号:20120320)，体质量(160士g>g}l}机分为PUUO组(8只)、PUUO+EPO组(8只)和假手术组(8只)二大鼠均按照啮齿类动物标准饮食，自由饮水，12 h:12 h自动昼夜循环，温度(21士2)0C，湿度(55士2)%。

1.2动物模型制作和标本收集PUUO组和PUUO+EPO组幼鼠，经100 g/L水合氯醛水溶液(3-5 mL/kg，腹腔注射)麻醉后，置于保温板匕手术期间监测直肠温度并保持在35.5}37.0 0C。经腹部正中切口暴露左侧输尿管，在肾静脉和腰静脉之间钝性分离输尿管后，在输尿管下方沿腰大肌肌束纹理钝性分离-长度为0.5-0.7 cm的纵沟，将输尿管包埋人纵沟后，用5-0丝线缝合纵沟两侧肌束，构建类似于人类肾盂输尿管连接部狭窄的幼年大鼠模型二PUUO+EPO组术后给予EPO腹腔注射(500 U/kg)，首次于术后1h给予，其余隔天1次，共4次;PUUO组腹腔注射同等剂量的9 g/L盐水，时间点同PUUO+EPO组。假手术组幼鼠同样在肾静脉和腰静脉之间分离左侧输尿管，但不包埋。术后1周进行MRI检查，处死大鼠前收集左侧肾脏标本，置于冰上迅速分离:’肾脏上极置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，供免疫组织化学检测;’肾脏下极在显微镜下分离为内髓、皮质加外髓外带;内髓进-步分为2部分，置于2个冻存管内液氮冷冻后，放人-80℃冰箱备用。

1.3免疫组织化学多聚甲醛固定标本，常规石蜡包埋，m切片，65℃烤片30 min，梯度乙醇脱蜡至水，过氧化氢孵育消除内源性过氧化物酶,PBS清洗后，微波抗原修复30 min，正常山羊血清工作液封闭后滴加兔抗鼠A QP2多克隆抗体(1:300)4℃过夜，PBS清洗后滴加生物素标记羊抗兔二抗，37℃孵育15 min,滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37 0C孵育15 min，辣根过氧化氢酶-二氨基联苯胺显色试剂盒显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。阴性对照采用PUUO组切片、PBS代替-抗，其余步骤均相同。

1.4荧光定量PCR取出-80℃冰箱内冻存的肾脏内髓标本，置于研钵内，剪碎，加人0.5 mL液氮快速研磨，待组织研成粉末后，按照RNAiso说明书步骤，加人RNA提取试剂，提取总RNA，待RNA干燥后加人20},},L RNase-Free Water溶解。吸取-部分进行RNA浓度、纯度测定，同时吸取6},L按照反转录试剂盒说明步骤进行cD1VA第-链合成。按照荧光PCR试剂盒说明步骤，添加相关试剂、混匀后分装为25},L的反应体系，每个标本6管，以增加结果可重复性，同时设置相同管数的(3-acti。作为内参。AQP2引物序列:Fl;5’-CTTCGAGCTGCCTTCTATGTG-3‘;R1:5‘-<}GGGGAA-CAGCAGG'lAGTTGT-3'0(3-actin引物序列:F1;5'-TCA-CCATGG}TGATGATATCGC-3’;R1:5'-CGTGCTCGAT-GGG GT ACTTCA-3'。使用ABI 7500型荧光PCR仪进行扩增反应条件:95 0C,10 min预变性;95 0C,15 s变性，60 0C,1 min退火延伸，总共40个循环二结果经ABI 7500 Fast System软件分析，记录各组AQP2和相应内参,}Ct以及组间AQP2 mRNA表达倍数。

1.5 Western blot取低温冰箱冻存内髓标本，置研钵内，冰上研碎后，按照组织蛋白提取试剂盒说明步骤，加人组织裂解液和蛋自酶抑制剂混合物，冰上孵育20 min,4 0C,10 000 g离心20 min后，取上清，加人蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5 min。制作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酚胺凝胶，每个标本蛋白仁样量为20 O,L，恒压电泳，半干转膜，将膜置于封闭液中常温封闭1h后，-抗(1:1000)孵育，4℃冰箱过夜。洗膜后置于二抗(1:2000)中室温孵育60 min。暗室内在膜[滴加ECI发光试剂，胶片曝光3-5 min，显影液显影后定影。胶片经凝胶灰度值分析软件分析，以各组AQP2条带灰度值除以相应内参条带灰度值，比较3组之间的相对值。

1.6统计学处理采用SPSS 10.0统计学软件进行分析，数据采用无士、表示。两组间比较采用t检验，3组问比较采用-单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MRI检查术后1周，对-大鼠幼鼠进行MRI检查。结果显示手术组左侧肾脏均有轻度积水，见图I,

2.2免疫组织化学测定结果AQP2阳性细胞呈棕黄色，主要集中在内髓集合管，位于主细胞顶端膜和胞质中。假手术组染色强度最明显，PUUO+EPO组次之，PUUO组最弱，但仍有微弱表达〔组织学上可见PUUO+EPO组和PUUO组集合管管壁变薄、管腔增大，明显不同于假手术组，见图20 

2.3荧光定量PCR结果3组AQP2和相应内参荧光值达到既定阑值所经历的扩增循环数Ct值，见表1,3组间比较差异有统计学意义，假手术组AQP2 mRNA表达最高，PUUO+EPO组次之，PU UO组最低(P<0.05)。经公式2-“vc}计算组间AQP2 mRNA表达量的相对倍数，结果显示假手术组是PUUO+EPO组的2.1倍、是PUUO组的9.2倍，PUUO+EPO组是PUUO组的4.3倍，见图3}

2.4 Western blot结果曝光胶片经凝胶灰度值分析软件分析，3组之间AQP2蛋白条带相对于内参的灰度值，见表2,3组之间比较差异有-统计学意义。假手术组表达量最高，PUUO+EPO组次之，而PUUO组表达量最低(P<0.05)，见图4

3讨论

先天性肾积水临床常见，由于输尿管的机械性或功能性梗阻，导致肾小球滤过率、肾小管处理水盐等功能障碍。然而，由于缺乏对先天性肾积水自然病程的了解，目前对先天性肾积水的处理尚存在争议，并不提倡早期手术干预。研究发现，输尿管梗阻后肾脏尿液浓缩功能的下降与肾小管各段水盐通道表达改变有关6。AQPs是-类对水具有通透性的膜蛋白总称，目前在肾脏发现了8种AQPs，其中AQP1}在调节水的运输中起关键作用。AQPl分布于近曲小管和髓襟降支，AQPZ分布于集合管顶端膜，AQP3,AQP4分布于集合管基底膜。AQP2是血管升压素调节集合管对水通透性的主要靶分子，在尿液浓缩中起重要作用。文献报道，输尿管梗阻可使肾脏AQPs表达下调，导致肾脏处理水的功能障碍。本课题组对先天性肾积水患儿手术肾脏标本进行检测，同样发现AQPl-4表达均下调LS。EPO最初被认为是-类通过抗凋亡作用来调节红系祖细胞增殖与分化的细胞因子。胚胎时期，肝脏是EPO的主要产生器官，而出生后，肾脏是EPO的主要产生器官，接近体循环总量的90%，肾皮质小管周围的纤维母细胞是产生EPO的主要细胞[9]。自1977年从1位再生障碍性贫血患者尿液中纯化分离得到EPO后，重组人EPO用于治疗慢性肾病性贫血和非骨髓恶性肿瘤患者化疗导致的贫血变为可能。

然而，越来越多的证据表明，EPO有较多独立于其促红细胞生成的其他生理功能，其可以通过旁分泌和自分泌的形式缓解原发和继发性原因导致的细胞死亡。近来体内外实验表明EPO可以缓解肾脏细胞损伤。Rj iba-Touati等[12-13]报道，EPO可以促进顺铂导致的急性肾衰竭(ARF)大鼠肾功能恢复。Srisawat等4-报道EPO可以缓解单侧输尿管梗阻所致肾脏小管间质损伤。虽然Gong等〔5〕报道EPO可以预防缺血再灌注损伤所致肾脏AQP2表达下调，但EPO对输尿管梗阻所致AQP2下调有无保护作用尚未见文献报道。不可否认输尿管梗阻所导致的肾脏病理生理改变与ARF及缺血再灌注所致肾损伤存在差异。但输尿管梗阻后，肾孟内压力升高，压力逆行传导，肾小管内压力-也随之升高，-方面会压迫小管周围的细胞，另-方面会压迫小管周围的血管，导致细胞缺氧缺血，此部分机制与急性肾小管坏死所导致的ARE以及缺血再灌注导致的肾损伤存在相似之处。从免疫组织化学图片上也可以看出，手术组的集合管管壁较假手术组薄，管腔增大，也可以证明输尿管梗阻后，集合管内压力会升高，管壁细胞受压，也可以证明本研究所做的输尿管部分梗阻模型是成功的。因此，推测EPO对因输尿管梗阻所导致的肾损伤也有保护作用，且叮以防止肾脏AQP表达下调。目前尚没有完全模拟临床先大性肾积水患儿的动物模型。本研究采用经典的输尿管腰大肌理植法建立输尿管部分梗阻幼年SD大鼠模型.并给予EPO干预，以检测EPO对输尿管梗阻肾脏AQP2的作用。结果显示，PUUO+EPO组AQP2蛋白表达水平虽然低于假手术组，但是显著高于PUUO组，差异均有统计学意义，这与Gong等报道的结果类似。

同时，PUUO+EPO组AQP2 mRNA表达水平也显著高于PUU 0组。说明EPO可以从mRNA和蛋白水平促进PUUO大鼠肾脏AQP2的表达。文献报道，EPO可以通过缓解内质网应激所致细胞凋亡以及氧化应激所致细胞损伤来保护肾脏12.15Gong等认为EPO通过抑制NO的合成，进而缓解肾脏缺血损伤，lei止肾脏AQP2下调。推测其原因还有:(1)减轻肾脏负担:当肾小管受压、缺氧缺血时，肾皮质小管周围的纤维母细胞功能受损，合成EPO减少，此时若给予外源性EPO，可以缓解肾脏负担，从而减轻肾脏进-步损伤。(2)防止集合管细胞凋亡，促进细胞修复和再生。总之，本研究结果表明，EPO不仅可以从蛋白水平防止梗阻肾脏:4QP2下调，还可以从基因水平防止AQP2 mRNA表达下调。但其具体机制尚不完全清楚，有待进-步研究。此外，PPO是否可以促进手术解除PUUO的幼鼠肾脏A QP2尽快恢复表达，也需进-步实验证明