COX-2抑制剂对幼鼠海马CA1区锥体神经元钠通道的影响

在花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢通路中的诱导型酶环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在病性发作导致局部微环境改变致炎性反应因子过度表达而激活.对神经元的电活动和突触联系起到调制作用o-z}o COX-2及其代谢产物在中枢起多种调节作用，与长时程突触可塑性形成和突触重构密切相关_3-5}o CDX-2抑制剂能通过抑制COX-2的活性逆转长时间响性发作后导致的海马异常突触重构.性发作导致突触通路内的电活动模式异常，促进兴奋性神经递质释放，改变离子通道通透性，启动细胞信号转导机制，使神经元电生理特性发生改变及异常突触联系形成。本实验于2011年1月进行，以观察COX-2抑制剂NS-398对大鼠海马CA1区锥体神经元电压依赖性钠通道的影响，探讨抗癫病机制的电生理学基础。

1材料与方法

1.1离体海马脑片的制备选用出生14 d左右的清洁级SD大鼠.迅速断头取脑，置于用氧混合气(95000:和5%CO2)饱和的0-4 0C蔗糖人工脑脊液(ACSF)成分(单位:}mol/L):2.0 KCI，2.0 MgSO}，28.0 NaHC03.1.25 NaHz P04,0.5 CaCl2,10.0 glucose)中冷却5-}-10 min。将脑组织切割成含海马的脑组织块。

供氧混合气条件下，在振动切片机土用刀片沿海马长轴制备出厚为200--400}m的海马脑片，置于氧混合气饱和的氯化钠ACSF巨(成分(单位:}mol/I):125.0 NaCl;2.OKCI·2.0 MgS04，28.0 NaHC03，1.25 NaHzPC),，0.5 CaCl=，10.0 glu-cose)」中，在孵育杯上室温孵育1-2 h，使脑片从机械操作和短暂缺氧中恢复。

1.2细胞内全细胞记录

玻璃毛胚管的外径1.0，内径0.5~用P-97水平玻璃电极拉制仪(Sutter公司)拉制，拉制好的电极尖端直径约1 pm,灌注电极内液后阻抗约为3^}7 M}}拉制好的电极接着灌注电极液，在阶跃模式(episodic模式)中，通过相应的刺激方案(protocol)可记录到钠电流。在实验中。首先将细胞膜电位钳制于-70 mV(海马锥体神经元细胞的静息电位)，记录电位经微电极放大器放大后经Digidatal 1322A进行A/D转换，由clampex软件进行数据采集和记录。

1.3统计学方法记录到的实验数据用clampfit 9.0,origin 7.5软件处理分析。实验结果用x士、表示，用t检验方法进行统计.PGO.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1 NS-398能抑制钠电流的幅度及密度

首先研究NS-398对最大钠电流幅度的影响。在形成全细胞记录模式后，在episodic的记录模式下，在静息电位(-70 mV)的基础上，给予-30 mV(最大激活电位)的指令电压刺激，时程为100 ms,记录这一指令电压激活的内向电流，即最大钠电流，对应的幅度为最大钠电流幅度，其与细胞膜电容的比值称为最大电流密度(Imax/cm)。溶液中加人钾通道的抑制剂四乙胺(TEA)和4_氨基毗陡(4-amin-opyridine,4-AP，以及钙通道的抑制剂氯化福(CdC1}>。加人终浓度为1}mol/L(}M)钠通道阻断剂河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)后.如图1所示.内向电流被完全阻断，从而证明记录到的内向电流是TTX敏感型电压依赖性钠电流。本实验没有记录到非.X敏感型电压依赖性钠电流。加人终浓度为10}M的NS-398能明显抑制最大钠电流幅度及最大钠电流密度(PLO.0l)，洗脱后恢复到正常水平(正常状态下Imax/cm=一95.43士10.56 ,一pF，加人NS-398后Imax/cm=-48.63二9.8;}pA一pF.洗脱NS-398后Imax/cm一-79.13}11.35 pA;一pF，二一的，如图2,3所示。

2.2 NS-398对钠电流密一电压曲线的影响

NS-398对钠电流的电流密度一电压关系曲线的影响:为了确定COX-2抑制剂NS-398对钠电流的幅度以及钠电流密度的抑制是否通过作用钠通道的激活时程，在静息电位(-70 mV)的基础上，给予一系列从一70 mV到40 mV的指令电压刺激，时程为100 ms、步宽为10 mV，记录这一系列指令电压激活的内向电流，即电压依赖性钠激活电流，如图4所示。分析时求每个细胞的同步指令电压相对应的电流密度的平均值，将这些平均值与相应指令电压值作图，绘制成平均电流密度一电压关系曲线图，如图5所示。钠通道在去极化到一30 mV左右时被最大程度地激活，-30 mV是最大激活电位，此时钠通道达到最大激活电流幅度，电流密度也达到最大值。加人20}M的NS-398能明显抑制电流密度，而且在最大激活电位时抑制最明显(PCO.0l),抑制呈电压依赖性。但是加人NS-398不能改变其最大激活电位。

2.3 NS-398对钠电流的激活曲线的影响

以图4的指令电压为横坐标，对应的电导G/Gmax为纵坐标，可得钠电流的激活曲线，如图6所示:GCV)=Imax/(V-VNa)(1)其中VVa是反转电位，V是指令电压，Imax是最大电流幅度，G}V)是指定电压对应的电导。激活曲线用玻耳兹曼(Boltzmarm)方程进行拟合:

2.4 NS-398对钠通道电压依赖性失活的影响

为了确定NS-398对钠电流的幅度以及钠电流密度的抑制是否通过作用钠通道的失活时程，在静息电位一70 mV的基础上，先给予一系列从一80 mV到40 mV、步宽为10 mV、时程为100 m、的指令电压刺激，短暂恢复到静息电位水平(2.5 ms)后.再给予一20 mV、时程为50 ms的指令电压刺激，记录这一系列指令电压激活的内向电流，即电压依赖性钠失活电流，如图7所示。分析时求出每步指令电压对应的电流幅度与最大电流幅度的比值(I/Imax).以指令电压为横坐标，I-'Imax为纵坐标，绘制给药前、加人NS-398这两种状态下电压依赖性钠失活电流的失活曲线，见图8用Boltzmarm方程进行拟合:式中Imax为最大失活电流，V为指令电压.V,:为半失活电压，Km为斜率因子(反应失活速度的快慢，Km越大，失活速度越慢)。可通过失活曲线的左移或右移以及半失活电压VZ等来判断药物对通道的影响。加人20 uM NS-398，电压依赖性钠失活电流的失活曲线明显向负极化方向移动(左移}.2 mV,P}0.05)，正常状态下V:35.82--L1.42 mV,Km=8.65士0.89.加人NS-398后，V41,l1士2.91 mV,Km=7.62士1.19;洗脱}1S-398后失活曲线变化不明显。表明相同指令电压刺激，加人NS-398组的I;Imax比正常组减小，证明NS-398能明显延长电压依赖性钠电流的失活时间

3讨论

脑片培养一般多选用出生m}a的新生鼠，范围多见于出生30 d以内，鲜有成年鼠的实验报道，因为成年鼠脑片培养不易存活。因我们前期实验主要研究发育期大鼠难治性癫病的发病机制，选择出生后映d大鼠造模，且这个时期大鼠脑区细胞构筑已经形戎.培养后细胞构筑、纤维联系同在体脑比较接近，因此本实验选用出生后14d大鼠来做相关研究。

研究发现COX-2在未成年大鼠脑内树突的表达变化过程和己知的组织发生学的变化以及活动依赖的突触重塑的重要时期互相吻合。表明COX-2和它的各种前列腺产物可能在脑内兴奋性神经元的突触后信号传递中具有重要的作用。

内源性PGE是突触生理活动中重要的调节因子，其集聚可能导致突触功能失调-9o PGE2与海马神经元突触前膜EP2受体结合，在兴奋突触传递过程中起到逆行信使的作用，诱导突触后细胞发生去极化，Ca进人突触后神经元，当兴奋性突触成功诱发突触后细胞的动作电位时，会产生生物化学反应或营养因子，稳定此时正在发放传人冲动的兴奋性突触，即形成新的突触联系，依赖突触前纤维的电活动，COX-2作为逆行信使的作用，作用于突触前膜.改变突触前纤维电活动，促进兴奋性递质释放，调节突触后细胞的性质。

目前C OX-2参与突触可塑性的间接依据已很多[1工簇，有关COX-2抑制剂对Ca一通道及长时程增强等研究较深人二12 13，但有关对Na一通道的研究目前报道并不多，而Na一通道在癫I?的发病机制及抗癫病药物的研发方面是非常重要的靶点。本文研究了NS-398对致病后海马脑片锥体神经元电压依赖性钠通道的激活时相、失活时相的影响，探讨它对钠通道的作用机制。结果发现:(1)NS-398能明显抑制电压依赖性钠电流的幅度以及钠电流密度，但是不能改变钠通道的最大激活电位，表明NS-398不改变钠通道的基本电学性质;(2)NS-398不能明显改变钠通道的电压依赖性激活时相的电导，表明NS-398对钠电流的抑制不是通过作用钠通道的激活时相而实现的;(3)NS-398作用于钠通道的失活时相，使失活曲线向负极化方向移动，能延长电压依赖性钠电流的失活时间。前人的研究发现癫病发生时，神经元细胞膜对a一的通透性明显增加，使得大量的Na一进人细胞，同时由于Na十、K+ATP酶活性降低(ATP消耗增加所致)，使得Na十主动外运减少泣，这样细胞内}a一浓度升高，其结果是膜的兴奋性增加，神经元发放动作电位频率增加，导致突触后膜神经递质的释放增加，引起神经网络的过度兴奋。可见电压门控型离子通道是神经递质释放的关键要素，因此，它们成了抗癫病药(AED)的重要靶点。典型的作用钠通道的药物卡马西平和苯妥英钠主要通过三方面影响钠通道而起作用①降低电压依赖性钠通道电流幅度;②使钠通道的不应期电位向超极化方向移动;③延长不应期，不应期的延长导致钠通道开放频率下降，尤其是在慢性癫'i}的异常高频率放电的情况下作用越明显。本文结果表明，与上述抗癫病药物的作用机制相似，NS-398能降低电压依赖性钠通道的电流幅度以及延长钠通道的不应期。NS-398延长钠通道的不应期是通过延长钠通道的失活时相和失活后恢复时相而实现的，钠通道的失活时相以及失活后恢复时相的延长导致钠通道的不应期延长.从而导致钠通道开放频率下降，神经元发放动作电位频率也相应下降，最终导致神经递质的发放减少。

总之，COX-2抑制剂能抑制大鼠海马脑片CAl区锥体神经元电压依赖性钠通道，延长电压依赖性钠电流的失活时间;减少Na+电流，延缓动作电位的发放和传播，降低神经元的兴奋性。

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