结核分枝杆菌基因突变检测方法研究进展

结核病是一种严重危害人类健康和社会发展的慢性传染病，自1993年WHO宣布全球紧急状态以来，结核病的疫情一直面临着多重挑战。H37Rv株的全基因组测序工作一比的完成，使人们开始从分子水平认识和研究结核分枝杆菌的遗传本质，为开展结核病基因研究提供了理论基础.各种针对结核分枝杆菌耐药基因、毒力相关基因、遗传变异等方面的研究都取得了突变性进展，开发出的新诊断技术、新疫苗、新药物成为人类战胜结核病新的希望和机遇。这些新诊断技术、新疫苗、新药物的研究大多建立在结核分枝杆菌相关重要基因的突变和功能研究基础上，因此，对基因的突变研究显得尤为重要.成为当前结核病研究领域的热点。过去卜几年，分子生物学的迅猛发展产生了多种结核分枝杆菌基因突变检测方法.这些技术依据检测原理可分成不同的种类。笔者就结核分枝杆菌基因突变检测方法做一综述，特别对近期出现的新技术进行详细讨论。

一、以构象为基础的检测方法

1.聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP):PCR-SSCI〕是1989年由Orita等3i创建的筛查点突变的一种技术，是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。其基本原理是单链DNA在某一种非变性环境中会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使单碱基变化都能导致这种空间构象的改变导致在非变性聚丙烯酞胺凝胶中电泳迁移率不同，产生不同的泳动带，从而将正常链与突变链分离出来。该方法自发明后即被广泛应用于结核分枝杆菌耐药基因突变的检测C'--s，直接用于痰标本耐药基因的检测也显示了较好的敏感度和特异度附万。该技术只能明确存在碱基置换，而确定其碱基置换的性质必须经过DNA测序，是测序之前突变筛查的常用手段。

2.变胜梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electro-phoresis,DGGE):DGGE最初由Fische世纪80年代初期发明，主要是用于检测DNA片段中的点突变。不同的双链DNA片段因为其序列组成不同，其解链区域及各区域的解链条件变性剂浓度也不同。同样长度但序列不同的DNA片段在递增的变性剂浓度梯度中电泳时，会在各自解链区域的变性剂浓度处发生部分解链，导致迁移率改变，而将组成不同的DNA片段分开。值得注意的是，DGGE在分析每一特定的PCR片段之前.需要通过预试验来确定其最佳的电泳条件.以获得最大的分离度。用DGGE检测结核临床标本利福平耐药，其基因型与测序结果符合率很高。虽然该方法可以有效检测基因突变，但是，目前该方法更多地应用于微生物分子生态学研究的各个领域，成为研究微生物群菌落结构的主要分子生物学方法之一。

3.PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restricted frag-ment length polymorphism,PCR-RFLP):PCR-RFLP在结核领域最为人所熟知的应用就是其DN A-指纹技术应用于跨国结核病疫情的追踪[mo，而其原理就是特定的限制性核酸内切酶具有识别并剪切特定的DNA序列位点的能力。因此，特定的DNA被限制性内切酶水解后其片段长度发生变化，通过琼脂糖凝胶电泳可反映DNA特定区域的结构改变，如点突变、缺失、插人和重排等，从而体现出各样本间的差异性。该技术操作简便，仅为PCR加上限制性内切酶·复现性良好.可检出1个碱基的突变研究者进行了一系列试验来检测结核分枝杆菌的耐药性.分析特定基因位点的点突变，结果显示该技术具有高度的特异度主吕

二、以荧光共振能量传递为基础的检测方法

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是用于对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法当一个供体荧光分子的荧光光谱与另一个受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光.同时供体荧光分子白身的荧光强度衰减.称为荧光共振能量转移。基于FRET的儿种突变检测方法需要针对特定的突变位点或多态性位点设计并合成序列或位点特异性探针.因此.该类方法大多用于已知突变位点或是对位点的多态性较清楚的突变检测。

1.Taqman探针一法:用于对特定位点单核昔酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的检测。应用一对双标记Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型;用两种荧光染料Fam,Hex(Vic)分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。

2，分子信标(molecular beacon):分子信标是可以特异识别核酸序列的具有茎一环结构的寡核营酸荧光探针，探针两端分别标上一个荧光基团和淬灭基团，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近，并且不会产生荧光当有靶序列存在的时候，靶序列和分子信标的探针序列杂交形成有一定刚性的双螺旋结构，导致分子信标的构象改变，干的部分打开，荧光基团与碎灭基团分开.二者之间的能量转移终止，在有相应的单色光激活时，荧光基团发出荧光。荧光强度与靶序列的多少成正比下m-分子信标不仅可以用于基因的定量、定性检测，还可以用于基因点突变等的分析等。

三、异源双链结构分析为基础的方法异源双链核酸是指来源不同的2种或2种以上的核酸分子同时存在于同一溶液中时‘其同源区域可借碱基配对形成双链核酸。异源双链内由于存在碱基错配或不配区域，在链内局部可形成凸起或泡，在非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳中，其泳动速度变慢，双链同源性越高，其泳动越快。

1.异源双链分析法(heteroduplex analysis,HA):突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其碱基错配处会形成1个突起，在非变性凝胶中电泳时.会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率，从而达到诊断碱基突变的目的。该法与SSCP相似，只适合于小片段的分析.所不同的是SSCP分离的是一单链DNA.HA法分离的是双链DNA但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用·两者结合使用·可使突变检出率提高。Saribas等zap认为该方法有很高的敏感度和特异度.可以快速检测利福平耐药z.变h}高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography.DHPLC):DHPLC方法是一种检测基因突变的新方法.主要用来分析异质性双链结构。它利用野生型和突变型DNA形成异源双链，在变性条件下，依靠双链碱基组成的构象差异，最终表现为洗脱峰形的差异显示突变的有无来进行分析该技术在结核分枝杆菌的耐药基因突变检测研究中得到了广泛的应用19-21 DHP工尤突变检测技术是高通量筛选DN A序列变异的最新技术，在结核病研究领域.除耐药基因检测外，还可以用于基因分型、序列多态性分析等，红，但是该技术所需设备价格昂贵·只能在一些大型的实验室中使用，限制了此方法的应用.同时.该技术只能检测杂合突变是其主要不足之处。在SNP筛查的检测通量、敏感度与成本等方面与最新的高分辨率熔解(high resolution melt,HRM)技术相比都明显落后。

3.Surveyor酶法:Surveyor酶是植物中提取的核酸内切酶，对DNA错配部位有高度选择性，它与普通的核酸内切酶不同，其酶切位点没有核昔酸序列的特异性，只识别异源双链中单个碱基错配形成的泡或未配对的多个碱基形成的环，从错配部位的每一条链的3‘端切断双链DNA。无基因突变存在时.样本与野生型PCR产物杂交形成同源双链，Surveyor酶找不到酶切位点而不能发挥作用，电泳图谱上仅为1条带;有点突变存在时.杂交后产物为配位完好的同源双链和错配有凸起的异源双链。Surveyor酶可将异源双链从错配部位切开.电泳图呈现3条带.1条为同源双链条带.另外2条为被切断的异源双链.2条链的长度总和等于同源双链的长度。如果异源双链中有多个错配部位.则Surveyor酶可有多个作用位点，产生不同长度、不同种类的酶切片段，呈现多种带形的电泳图谱互o Surveyor酶法无需大型设备，仅使用普通的非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳即可，也可通过琼脂糖凝胶电泳判断有无突变的存在。方法简便稳定，便于推广。该技术在其他疾病的基因突变中有较多的应用在结核耐药基因突变方面应用较少4.PCR-通用异源双链扩增子(PCR-universal heterodu-plex generator,PCR-UHG):Williams等邵创立了并评价利用PCR-UHG技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法:先用巢式PCR扩增特异的:poY基因片段，再与根据结核分枝杆菌rpoB基因Rif区合成的通用异源双链扩增子UHG探针杂交，如果标本中的结核分枝杆菌rpoB基因有突变，则会产生异源双链，通过电泳可分离异源双链，确定其是否有利福平耐药性。此方法对涂片染色阳性、未经治疗的患者尤为适合。Mayta等进一步评价了该技术在发展中国家诊断痰涂片阳性肺结核和快速发现耐多药结核病的可行性，认为其具有高度的特异度、敏感度和预测值。

四、毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)CE是近几年发展起来的高效快速分离、分析技术。在散热效率高的极细的毛细管内，在有或无凝胶的筛分机制和高强度电场的双重作用下，DNA片段因离子表面积和分子外形的变异导致的迁移时间不同而检测突变。CE技术能够分析长至数千的碱基片段，可以同时处理多个样本，而且样本的需求量极少。基于毛细管电泳的单链构象异构多态性(CE-SSCP)，结合了SSCP检测基因突变的简单快速和CE的仪器自动化，实现了快速和自动在rpoB基因、inhA mabA基因调节区、katG基因检测单碱基突变

五、高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)HRM是新近发展起来的SNP及突变检测工具.也是当前比较热门的基因突变检测方法。HRM是由美国犹他大学Carl Wittwer实验室一与美国Idaho公司于2003年共同合作开发的一种建立在实时荧光定量PCR基础上的技术3031，不同核酸分子的UC含量、GC分布不同，因此双链DNA分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM就是根据熔解曲线的不同，根据解链温度曲线与标准曲线的对照，准确区分野生型、杂合突变、纯和突变。此法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析，闭管检测.避免了污染造成的假阳性，同时可以检测已知和未知SNP，但是不能测出具体位置和类型。HRM技术在结核病耐药领域得到了广泛的应用.利用HRM对常见抗结核药物耐药基因的检测Caz-a-7，并已有相关的商品化检测试剂。

六、DNA直接测序方法DNA测序技术是分子生物学检测的金标准，是检测结核分枝杆菌基因突变最直接的方法。该技术不断发展，从最初的双脱氧核昔酸末端终止测序法发展到今天第三代测序技术，高通量测序技术日渐成熟，为快速测序检测突变提供了技术支持。

七、商品化的突变检测技术

1.GeneXpert检测系统:该系统由美国Cepheid公司研发，整合了传统PCR检测所需的3个步骤(样品制备、扩增和检测)，并把它们自动化，提供样品到GeneXpert的反应盒，系统自动进行核酸提取、核酸扩增以及目标序列的检测。作为WHO推荐的一种检测耐药基因突变的方法，结核分枝杆菌及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测(Xpert Mtb/RIF)采用了GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的81 by利福平耐药核心区检测其是否发生突变，诊断是否对利福平耐药。2010年的多中心验证评估结果表明，该检测系统检测利福平耐药的敏感度和特异度高达97.600和98.1。

2.结核分枝杆菌线性探针技术(line probe assay,Li-PA);LiPA是一种基于PCR扩增的方法，根据固相反向杂交原则设计的检测方法，将靶DNA用带有生物素的引物进行PCR扩增，带生物素的PLR产物与膜固定的捕获探针杂交，再加人交联碱性磷酸酶的链霉亲和素，洗去未结合的链霉亲和素.加人底物显色，由此来检测靶DNA特定基因的碱基突变Css7。目前国际上应用最多的LiPA是德国RAIN公司的GenoType MtbDRplu:耐药检测试剂盒，通过检测rpoB}KatG基因和:nhA基因启动子区的突变情况确定利福平和异烟脐的耐药性，国际上很多实验室对其进行了应用评估，其特异度和敏感度均较高3.基因芯片技术:是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序的固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定仪器对杂交信号强度进行分析，从而判断样品中靶分子数量。目前，已经商品化DNA微陈列芯片法在国内多中心验证结果表明，该方法检测利福平和异烟拼耐药，其敏感度和特异度分别为87.56%和80.340 0,97.95%和95.82 0 o`3'-。基因突变检测技术的快速发展，可以从分子水平来探索和研究结核分枝杆菌的各种遗传本质虽然有多种检测技术可供选择.但是各种检测技术仍然存在一定的局限性。因此.建立和选择一种快速、有效、经济的方法仍是今后一段时间内的目标。

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