结核分枝杆菌IFN-γ体外检测试剂的生产质量控制与临床研究探讨

结核分枝杆菌Y干扰素(interferon gamma,IFN-y)体外检测试剂盒主要是通过检测特异性IFN-y的释放来辅助诊断结核病或判定机体是否已经感染结核分枝杆菌的一种体外诊断方法1三由于检测方法的不同，结核分枝杆菌IFN-y体外检测试剂盒包含两种类型，一种是应用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS八)来定量检测特异性IFN-y的释放水平;一种是应用酶联免疫斑点法(en-zyme linked immunospot assay,ELISPOT)在单细胞水平定量检测分泌IFN-y的效应性丁细胞尽管两类试剂盒的检测方法稍有差异，但其工作原理基本相似，检测用途一致笔者将针对两类试剂盒的主要原材料、生产工艺、产品质量控制.以及临床研究的技术要求进行概述.为从事结核分枝杆菌INF y体外检测试剂盒人员提供参考。

原材料

一、主要生物材料主要生物原料包括IFN-y抗体、相关酶标记IFN-Y抗体、IFN-y标准蛋白、结核特异性刺激物(重组抗原或合成多肪)、阳性对照刺激物(刀豆蛋白或植物血凝素)等这类原料主要用于包被酶标反应板、刺激特异性IFN-y释放、检测工FN-y、制备校准品(标准品)等。兰要生物原料若为企业自己生产.应简述其制备程序。IFI\}-y抗体和相关酶标记工E:N y抗体应提供各级细胞库的详细制备过程和检定情况，以及抗体的生产工艺条件等资料相关酶标记1FV-y抗体还需提供标记酶的来源，标记方法和酶标记抗体的质量鉴定情况。结核重组抗原应提供工程菌的构建、各级种子库的制备.生产工艺条件等项资料.以确保工艺相对稳定}}-y标准蛋白如为重组来源产品.也需提供工程菌的构建、各级种子库的制备.生产工艺条件等项资料结核合成多胧应提供其合成方法、生产工艺条件和检定情况等项资料。刀豆蛋白和植物血凝素一般为商购原料以上生物原料若购买.其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商如生产工艺或供应商等有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。主要生物原料的常规检验项目一般包括:外观、纯度、相对分子量、蛋白质浓度、效价和功能性实验(至少应有阳性参考品符合率、阴性参考品符合率和最低检出限)，应符合企业生产规定的要求标记用酶若为辣根过氧化物酶，酶的纯度RZ值(德文Reinheit Zahl)应不低于。

二、生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)等。其中牛血清的检定项目至少应包括:外观、无菌试验、总蛋白含量和球蛋白含量等，13SA的检定项目至少应包括:外观、溶解性、总蛋自含量、总蛋自中的BSA含量、BSA的净含量等，质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准户二规定的标谁要求。此外，这些生物辅料还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品进行测定.均不能出现非特异性反应。

三、化学原材料

化学原材料的质量标准参照文献[3习分析纯级别进行检验，主要的检测指标包括:外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。在购入时，生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。

四、其他物料

1.酶标板或聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜板:酶标板或PVDF膜板应进行外观、吸附能力和精密性等的检测。吸附能力和精密性应采用合适的方法进行检验，一般用一定浓度的鼠IgG包被板条，再用一定浓度的羊抗鼠IgGHRP与其进行反应，通过酶标仪读数，计算不精密性(coefficient of variation,CV)，一般规定CV()应不高于15%

2.液体试剂装量瓶:各液体试剂应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如装量瓶的规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。一般规定装量应不低于标示量

3.其他材料:包括试剂瓶标签、豁胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则户二和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定户二建立相应质量控制。

主要生产工艺

一、半成品的制备程序

IFN-y抗体制备通常采用址G亲和层析或其他适宜方法进行;相关酶标记IFN-y抗体的制备通常采用常规过碘酸钠一乙二醇法或其他适宜方法进行酶标记;重组来源的」FN下标准蛋白和结核特异性刺激蛋白通常应用不同层析方法的组合来进行制备，以保证其纯度能,950a;结核特异性合成多肤通常应用固相合成的化学方法或其他适宜方法进行制备，以保证多肤在结构和纯度方面达到质量要求。

包被IFN-y抗体浓度和酶标记IFN-y抗体工作浓度的选定通常采用方阵滴定法进行;研究还应包括对包被液及包被条件，封闭液及封闭条件，干燥条件进行优化，以保证包被液能使IFN-y抗体很好地与PVDF膜结合，封闭液能很好的封闭PVDF膜上多余的结合位点，干燥条件保证在工作过程中抗体不会从固相载体上脱落;其余如反应板、阳性对照刺激物、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等要保证其稳定性符合产品要求。特别应注意的是，若以上液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

应对包被抗原板按半成品质量控制的标准进行抽样检定，并应符合相应项的规定要求。各种工作液应有明确的配方及严格的配制程序，其质量控制主要包括酶结合物的功能性实验及稳定性;各种溶液的外观、pH值等;酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标;终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。对于定量检测试剂，其标准品(或校准品)溶液应具有量值溯源性。

二、成品的分批、分装和包装按照文献[2i中《生物制品分批规程》、《生物制品分装和冻干规程》以及《生物制品包装规程》进行分批、分装与冻干以及包装。

质量控制

一、半成品质量控制以企业参考品进行半成品质量控制。ELISPOT方法检测的试剂盒检定项目至少应包括阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密性。ELISA方法检测的试剂盒检定项目除阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密性检定项目外，还应包括线性检测和最低检出量检测项目。阴性参考品和阳性参考品至少各5份，精密性参考品至少1份。

二、成品质量控制

(一)出厂检验ELISPOT方法的成品质量控制应包括外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密性检测项。ELISA方法的成品质量控制除以上4项外，还应包括最低检出量、线性、准确性和稳定性等检测项。两种检测方法，无论是应用新鲜血样还是冻存的细胞、冻存的培养上清或冻存的血浆，其阴性参考品符合率应不低于7500，阳性参考品符合率应不低于7500，精密性检测项的CV值应不低于3000。其他质控指标可参照型式检验中的有关检测项进行，或生产企业视质量控制情况而定

(二)型式检验由于该类试剂检测使用血液样本新鲜程度影响其检验结果，并且目前尚无供评价用的国家参考品，在进行国家规定检验或抽验时使用由第三方收集的血液样本进行质量评价，企业成品质量控制技术指标应考虑以下几点要求。

I.检验用样本的基本要求(1)应根据该试剂使用说明确定样本的采集量与采集用容器精密性检测用参考品如需使用新鲜血液，建议其采集数量大于注册标准中的规定数量。(2)阳性参考品中菌阳参考品宜采用1个月内确诊的痰涂片阳性和(或)培养阳性的结核病患者的血样;菌阴参考品采用1个月内痰涂片阴性和(或)培养阴性的临床疑似结核病患者的血样，如在随后的最终诊断为非结核病患者，则应给予剔除。由于阳性参考品存在被剔除的可能性，建议其采集数量大于注册标准中的规定数量。(3)阴性参考品应依照随机原则采集无结核病临床症状的健康志愿者的外周静脉血，采血后立即进行TB-PPD皮试或鉴别诊断用超敏反应原的同体双臂皮肤试验，24-v72 h后观察并记录结果。(4)送检厂家负责运输参考品血样，建议在采血后的2h内，最长不超过6h送至中国食品药品检定研究院承检科室。同时附送样品来源的详细资料，应包括阳性参考品的涂片和(或)培养的检测结果，应提供分装规格和分装数量的数据。

II.检测项目

1.物理检查:应对试剂盒外观、试剂盒中各液体组分(如阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物液、终止液等)以及酶标板或PVDF板外观等进行检查，应符合相应的质量标准。

2.阳性参考品符合率:至少10份以上结核分枝杆菌涂片和(或)培养阳性的结核病患者(菌阳)的新鲜外周抗凝血样本;至少10份以上结核分枝杆菌涂片和(或)培养阴性的临床确诊结核病患者(菌阴)的新鲜外周抗凝血样本，其阳性参考品符合率应不低于7500 3.阴性参考品符合率:至少15份无结核病临床症状的健康志愿者的新鲜外周抗凝血样本，其阴性参考品符合率应不低于7500。具体要求:无结核病临床症状的健康志愿者应包含不同等级的PPD皮试人群，即应包含PPD皮试强阳性者(72 h硬结或红晕直径)15 mm或伴有水泡),PPD皮试阳性者(72 h硬结或红晕直径妻5 mm)和PPD皮试阴性者(72 h硬结或红晕直径?}第十二条规定，结核分枝杆菌IFN-y体外检测试剂属第三类产品。《体外诊断试剂临床研究技术指导原则户〕中关于临床研究样本量的规定:第三类产品的临床研究的总样本数至少为1000例。生.样本的采集:以肝素钠或肝素铿抗凝的采血管进行样本采集。不建议采用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tet-raacetic acid,EDTA)抗凝的采血管进行样本的采集·这将会增加背景，从而对结果判读造成干扰5.对比试剂:应选择使用已经通过我国相关机构认证的同类型产品，同时应充分了解所选择产品的技术信息，包括方法学、临床使用目的和范围、主要性能指标、标准品或校准品的溯源情况、推荐的参考值(参考范围)等.以便对试验结果能够进行科学的分析。关于临床研究报告的撰写临床研究报告的格式及书写内容应包括以下项目。

临床研究

一、首篇首篇是每份临床研究报告的第一部分，所有单个的临床研究报告均应包含该部分内容。主要有封面标题、目录、研究摘要、试验主要研究人员的姓名、单位和在研究中的职责及其简历(歹」于附件中)、缩略语等。

二、正文内容和报告格式1.基本内容:应包括引言、研究目的、试验管理、试验设计、临床研究结果及分析、讨论和结论等。其中试验设计中应包括:样本量及样本量确定的依据;样本选择依据、人选标准、排除标准和剔除标准;样本采集、保存、运输方法等;金标准或对比试验产品的确立;临床研究用所有产品的名称、规格、来源、批号、效期及保存条件，对比试验产品的注册情况;质量控制方法;临床研究数据的统计分析方法;研究过程中方案的修改。2.情况说明:有关临床研究中特别情况的说明。

3.附件:应包括临床研究中所采用的所有诊断试剂产品的使用说明书、临床研究中的所有试验数据，以及主要参考文献等。讨论以上文章中的“原材料、主要生产工艺、质量控制和临I}研究”四部分主要是针对我国相关试剂和试剂盒的研究进石的探讨。如国外同类试剂或试剂盒在我国进行注册申请，霹符合《体外诊断试剂注册管理办法(试行)

三的相关规定《体外诊断试剂注册管理办法(试行)》第十条规定“境外生产企业还应当符合生产国或地区相应的质量管理体系要求。’《体外诊断试剂注册管理办法(试行)》第三十二条规定“申请境外产品注册，需要提供境外的临床试验资料。申请人应坐按照临床试验的要求，同时考虑不同国家或地区的流行病学背景、病原微生物的特性、不同种属人群所适用的正常参考值(或参考范围)等诸多因素，在中国境内进行具有针对性献临床试验。”因此，如国外同类试剂或试剂盒在我国进行申请注册，临床研究可参考文章中的相关部分。至于国外同类试剂或试剂盒的进口注册检定，要求与国内同类制品一样，可参考上述“型式检验”部分。

参考文献

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